Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

El objetivo general de este procedimiento es determinar las concentraciones de ácidos nucleicos y proteínas de forma precisa y reproducible utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes. Esto se logra seleccionando primero la longitud de ruta adecuada para la muestra que se va a medir. El segundo paso del procedimiento es medir un espacio en blanco.

A continuación, se mide la muestra de ADN o proteína. El paso final del procedimiento es guardar los datos en formato PDF o CSV. En última instancia, resultados altamente reproducibles para el ADN y las proteínas.

La cuantificación se puede obtener de forma rápida y precisa por este método. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, precisa y reproducible. Para comenzar el procedimiento de cuantificación de ADN, encienda el nano espectrofotómetro de especificaciones del BIOS.

Abra el software nano de especificaciones del BIOS desde el escritorio de la PC. Haga clic en la pestaña de ácido nucleico simple D-S-D-N-A. El software establecerá comunicación con el instrumento y ejecutará una secuencia de inicialización.

Esto verifica que el instrumento esté funcionando de acuerdo con las especificaciones. A continuación, seleccione la longitud de la ruta. En el control deslizante de longitud de ruta.

Hay tres opciones disponibles para muestras de volumen de microlitros: se pueden utilizar 0,2 milímetros o 0,7 milímetros. Y para muestras diluidas, existe la opción de usar un veté de cinco milímetros de longitud de trayectoria.

En esta demostración, se seleccionan 0,7 milímetros para medir una muestra de dos microlitros. Todos los cálculos se basan en la longitud de ruta seleccionada. A continuación, en el software, haga clic en la pestaña de configuración y seleccione la configuración de borrado automático.

Seleccione una toallita por una. Antes de la medición de la muestra, o cada vez que se selecciona una nueva longitud de trayectoria, se requiere una medición en blanco Para una pipeta de 0,7 milímetros de longitud de trayectoria, dos microlitros de agua o tampón en el pedestal. Haga clic en blanco para la medición de la pieza en bruto.

La ventana superior se moverá para hacer contacto con la gota de muestra y se podrán observar destellos de xenón. Una vez finalizada la medición, el limpiador borrará automáticamente la muestra. Ahora se puede medir la muestra.

Es importante utilizar una solución de muestra homogénea ya que hay partículas no disueltas. La partícula de muestra dará como resultado datos irreproducibles. Para evitar la introducción de burbujas de aire, aspire con cuidado dos microlitros de la muestra y, a continuación, pipetee la muestra de manera uniforme desde la punta de la pipeta hasta el pedestal.

Presione el botón de inicio en el instrumento. Al igual que antes, la ventana superior se moverá para hacer contacto con la gota de muestra y se pueden observar destellos de xenón para determinar la reproducibilidad, repetir la medición de la misma muestra tres veces, todos los datos registrados se guardan automáticamente como un archivo BUD. Para guardarlo como un archivo PDF o CCSV, haga clic en guardar P-D-F-C-S-V.

Los resultados también se pueden guardar como un archivo CSV utilizando la selección adecuada en la pestaña Guardar. La cuantificación de proteínas se puede realizar utilizando el método de absorbancia dos 80. Para la cuantificación de proteínas, seleccione la pestaña Cuantificación de proteínas.

Ingrese el coeficiente de extinción epsilon two 80 si se conoce, si no se conoce Epsilon two 80, calcule usando Epsilon two 80 calc seleccione 0.2 milímetros en el control deslizante de longitud de ruta para medir una muestra de tres microlitros. A continuación, en el software, haga clic en la pestaña de configuración y seleccione la configuración de borrado automático. Seleccione dos por dos toallitas para evitar cualquier arrastre de muestras y garantizar una lectura precisa.

Para medir una pipeta en blanco de tres microlitros de agua o un tampón en el pedestal, haga clic en blanco para la medición en blanco. A continuación, pipetee con cuidado tres microlitros de muestra de proteína en el pedestal. Sin introducir ninguna burbuja de aire para comenzar a medir la muestra, haga clic en iniciar en el software o presione el botón de inicio en el instrumento.

Repita la medición de la misma muestra tres veces para determinar la reproducibilidad mostrada. Estos son los datos de las mediciones en una muestra típica de ADN bicatenario. La fórmula utilizada para calcular la concentración de ADN es que la concentración de la muestra es igual a DF por la cantidad de OD dos 60 menos OD tres 20 veces NACF, donde DF es igual al factor de dilución de la muestra y NACF es igual al factor de concentración de ácido nucleico.

El factor de concentración de ácido nucleico se establece de acuerdo con el analito seleccionado. Se indica la concentración de ácido nucleico calculada y la relación OD 2 62 80. Esta tabla contiene los resultados de las pruebas de reproducibilidad para la cuantificación del ADN.

En conjunto, los datos muestran resultados que son altamente reproducibles, como lo demuestra la baja desviación estándar relativa de 0,26%Aquí se muestran los resultados representativos de un análisis de concentración de proteínas para BSA. La concentración de proteína en microgramos por mililitro se basa en el valor Epsilon two 80. Finalmente, en esta tabla se muestra un análisis de reproducibilidad de la cuantificación de proteínas.

La desviación estándar relativa de 0,51% indica que la especificación nanométrica del BIOS mide con precisión no solo el ADN, sino también las proteínas. Una vez dominado, se pueden analizar varias muestras en un minuto.