Name: Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprende a cuantificar ácidos nucleicos y proteínas con el espectrofotómetro BioSpec-nano usando volúmenes mínimos de muestra. Este método ofrece resultados altamente reproducibles con desviación estándar relativa inferior al 0.51%.

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1. Procedimiento para la cuantificación de ADN <ol><li> Encienda el instrumento. </li><li> Abra el software BioSpec-nano desde el escritorio del PC. </li><li> Haga clic en el simple de ácido nucleico-DNA de doble cadena pestaña (Figura 1). </li><li> El software se establecerá comunicación con el instrumento y ejecutar una secuencia de inicialización. Esto verifica que el instrumento está funcionando de acuerdo a las especificaciones. </li><li> Seleccione 0,7 o 0,2 mm en el control deslizante de paso de luz. Esto selecciona el paso de luz y todos los cálculos se basan en el paso de luz seleccionado. </li><li> Siguiente en BioSpec-nano clic software de configuración-Autowiping configuración. Seleccione 1 ó 2. </li><li> Pipetear 2 l (de 0,7 mm) H 2 O o tampón en el pedestal. </li><li> Haga clic en blanco o F6 para la medición en blanco. Cada vez que un nuevo paso de luz se ha seleccionado es necesaria la creación de un espacio en blanco. </li><li> Pipetear 2 l de la muestra en el pedestal. </li><li> Haga clic en Inicio en el software o presionar el botón de inicio en el instrumento. La ventana superior se mueve para hacer contacto con la gota de la muestra. Flashes de xenón pueden ser observadas. </li><li> Repita la misma muestra tres veces para determinar la reproducibilidad. </li><li> Todos los datos registrados se guardan como archivos. Yema. </li><li> Para guardar en formato pdf. O. Csv, haga clic en Guardar PDF / csv o F9. Los resultados también se pueden guardar como un archivo. Csv con la selección apropiada en la ficha Guardar. </li></ol> 2. Protocolo para la cuantificación de proteínas <ol><li> Seleccione la pestaña de proteínas cuantificación (Figura 2). </li><li> Introduzca el e280 coeficiente de extinción, si se conoce. </li><li> Si e280 no se sabe calcular utilizando e280Calc. </li><li> Seleccione 0,7 o 0,2 mm en el control deslizante de paso de luz. </li><li> Haga clic en Configuración-Autowiping configuración. Seleccione 2 o superior. </li><li> Pipetear 3 l (de 0,2 mm) H 2 O o tampón en el pedestal. </li><li> Haga clic en blanco o F6 para la medición en blanco. </li><li> Pipetear 3 L de muestra de la proteína en el pedestal. </li><li> Haga clic en Inicio en el software o presionar el botón de inicio en el instrumento. </li><li> Repita la misma muestra tres veces para determinar la reproducibilidad. </li><li> Todos los datos registrados se guardan como archivos. Bud </li><li> Para guardar en formato pdf. O. Csv, haga clic en Guardar PDF / csv o F9. </li></ol> 3. Los resultados representativos: 1. Resultados para la cuantificación de ADN La Figura 3 muestra los datos de las mediciones en una muestra típica de ADN de doble cadena. La concentración y la OD 260/280 coeficiente calculado también se muestran. Figura 4 contiene los resultados de reproducibilidad de los ensayos para la cuantificación de ADN. Los datos de las Figuras 3 y 4 muestra los resultados son altamente reproducibles como se desprende de la baja desviación estándar relativa de 0,26%. Nota 1: Inexactitud en la cuantificación de ADN pueden derivarse de la presencia de componentes de amortiguación que puede absorber en la región UV. También es necesario utilizar una solución de muestra homogénea. Como la cantidad de muestra que se está pipeta sólo 1.2 l pipeteado, cuidado de los volúmenes exactos sin la introducción de burbujas es necesario. 2. Los resultados de cuantificación de proteínas La Figura 5 representa el análisis de concentración de proteínas de BSA. La concentración de proteína mg / ml se basa en el valor e280. La Figura 6 muestra el análisis de la reproducibilidad. Es evidente a partir de la desviación estándar relativa del 0,51% que el BioSpec-nano mide la concentración de precisión - no sólo para el ADN, sino también para las proteínas. Nota 2: Factores que afectan la concentración de proteínas Determinación de la concentración exacta de la proteína es factible cuando hay efectos mínimos de la inestabilidad causada por el pH, tampones, la temperatura, ni aditivos. La mayoría de la proteína purificada pasa por varios pasos de procesamiento, por lo que es posible que la proteína puede contener tensioactivos u otros aditivos que pueden interferir con la formación de gotas. Para estas muestras, con el paso de luz de 5 mm celda de cuarzo es muy recomendable. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Analito ventana de selección para la cuantificación de ADN de doble cadena <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analito ventana de selección para la cuantificación de proteína marcada no <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Datos representativos para la cuantificación de ADN <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Datos de reproducibilidad para la cuantificación de ADN <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Los datos representativos para la cuantificación de proteínas <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt='"Figura'> Figura 6. Reproducibilidad de los datos de cuantificación de proteínas

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran, PhD es un empleado de Shimadzu que hace que el instrumento presentado en este artículo.

El BioSpec-nano ha sido diseñado para resolver los problemas actuales inherentes a los métodos de cuantificación de ADN, tales como inconsistencias en los resultados y el trabajo manual tedioso. Cada medida tiene tan sólo 3 segundos, lo que permite un biólogo molecular con experiencia para analizar varias muestras de 3-6 en un minuto. La función del limpiador único no sólo mejora el rendimiento de la medición, sino que también elimina la necesidad de limpieza manual de los soportes, lo que resulta insignificante en el remanente entre las mediciones. Además, las pruebas con tan solo 2 toallitas para muestras de ADN que contiene 1000 ng / mL, indicó arrastre a menos de 2 ng / mL. La disponibilidad de una celda de 5 mm de paso de luz proporciona una opción para analizar los ácidos nucleicos y diluir las muestras de proteínas y se extiende el uso de este instrumento para otras aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADN de timo de ternera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen bio-spec espectrofotómetro nano

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleicos procedimientos de cuantificación de ácido han avanzado significativamente en las últimas tres décadas. Cada vez más, los biólogos moleculares requieren constante de volumen pequeño análisis de las muestras de ácidos nucleicos para sus experimentos. El BioSpec-nano ofrece una posible solución a los problemas de la inexacta, no reproducibles, inherentes a los actuales métodos de cuantificación de ADN, a través de ópticas especializadas y un detector PDA sensibles. El BioSpec-nano también tiene funcionalidades automatizadas de tal manera que el montaje, la medición, y la limpieza son realizadas por el instrumento, eliminando así la colocación repetitiva, tediosa, e inconsistente de los elementos de fibra óptica y la limpieza manual. En este estudio, los datos se presentan en la cuantificación de ADN y proteínas, así como sobre la reproducibilidad y precisión. Contacto automático de muestras y análisis rápido permite la medición en tres segundos, lo que resulta en un rendimiento excelente. El análisis de datos se realiza mediante las características integradas en el software. La fórmula utilizada para calcular la concentración de ADN es la siguiente: Concentración de la muestra = DF · (DO260-OD320) · FNCA (1) Donde DF = factor de dilución de la muestra y la FNCA = factor de concentración de ácidos nucleicos. El factor de concentración de ácido nucleico se establece de conformidad con el analito seleccionado 1. Resultados de concentración de proteínas se puede expresar como mg / mL o como moles / L mediante la introducción de e280 y los valores de peso molecular, respectivamente. Cuando los valores de residuos de Tyr, Trp y cisteína (SS de bonos) son introducidos en la pestaña e280Calc, los valores de coeficiente de extinción se calculan como e280 = 5500 x (residuos de Trp) + 1490 x (residuos de Tyr) + 125 x (cisteína SS de bonos) . El valor e280 es utilizado por el software para el cálculo de la concentración. Además de la determinación de la concentración de los ácidos nucleicos y proteínas, la BioSpec-nano puede ser utilizado como un ultra-micro volumen espectrofotómetro para muchos otros analitos, o como un espectrofotómetro estándar con 5 células de paso de luz mm.

Esta comunicación se presentan datos sobre la precisión y la reproducibilidad de los BioSpec nano-Espectrofotómetro UV-VIS de ADN de doble cadena y cuantificación de proteínas. Incluso con ultra-pequeños volúmenes (1 a 2 L), la reproducibilidad es excelente, mientras que la función de limpieza automática mejora el rendimiento y los resultados en un mínimo de arrastre para obtener resultados más precisos.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Los procedimientos de cuantificación de ácidos nucleicos han avanzado significativamente en las últimas tres décadas. Cada vez más, los biólogos moleculares requieren consistencia...

El objetivo general de este procedimiento es determinar con precisión y reproducibilidad las concentraciones de ácidos nucleicos y proteínas utilizando un espectrofotómetro de microvolumen. Esto se logra primero seleccionando la longitud de trayecto óptico adecuada para la muestra que se va a medir. El segundo paso del procedimiento consiste en medir un blanco.A continuación, se mide la muestra de ADN o proteína. El paso final del procedimiento consiste en guardar los datos en formato PDF o CSV. En definitiva, resultados altamente reproducibles para ADN y proteína.La cuantificación puede obtenerse rápida y con precisión mediante este método. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, precisa y reproducible. Para comenzar el procedimiento de cuantificación de ADN, encienda el espectrofotómetro BIOSpec-nano.Abra el software BIOS spec nano desde el escritorio de la PC. Haga clic en la pestaña de ácido nucleico simple D-S-D-N-A. El software establecerá comunicación con el instrumento y ejecutará una secuencia de inicialización.Esto verifica que el instrumento está funcionando de acuerdo con las especificaciones. A continuación, seleccione la longitud de trayecto. En el control deslizante de longitud de trayecto.Hay tres opciones disponibles para muestras de volumen microlitro. Se pueden usar 0.2 milímetros o 0.7 milímetros. Y para muestras diluidas, existe la opción de utilizar una celda de trayecto de cinco milímetros.En esta demostración, se selecciona 0,7 milímetros para medir una muestra de dos microlitros. Todos los cálculos se basan en la longitud de trayecto seleccionada. A continuación, en el software, haga clic en la pestaña de configuración y seleccione la configuración de limpieza automática.Seleccione uno para una sola pasada. Antes de la medición de la muestra, o cada vez que se seleccione una nueva longitud de trayecto, se requiere una medición en blanco. Para una pipeta con longitud de trayecto de 0,7 milímetros, coloque dos microlitros de agua o tampón sobre el pedestal. Haga clic en blanco para realizar la medición en blanco.La ventana superior se moverá para hacer contacto con la gota de muestra y se podrán observar destellos de xenón. Cuando la medición esté completa, el limpiador eliminará automáticamente la muestra. Ahora se puede medir la muestra.Es importante utilizar una solución de muestra homogénea, ya que la presencia de partículas no disueltas puede afectar los resultados. Las partículas en la muestra darán lugar a datos irreproducibles. Para evitar la introducción de burbujas de aire, aspire cuidadosamente dos microlitros de la muestra y luego transfiera uniformemente la muestra desde la punta de la pipeta hacia el pedestal.Pulse el botón de inicio del instrumento. Como antes, la ventana superior se moverá para hacer contacto con la gota de muestra y se pueden observar destellos de xenón; para determinar la reproducibilidad, repita la medición de la misma muestra tres veces. Todos los datos registrados se guardan automáticamente como un archivo A BUD. Para guardar como archivo P-D-F o CCSV, haga clic en guardar P-D-F-C-S-V.Los resultados también se pueden guardar como un archivo CSV utilizando la selección adecuada en la pestaña de guardar. La cuantificación de proteínas se puede realizar mediante el método de absorbancia a 280. Para la cuantificación de proteínas, seleccione la pestaña de cuantificación de proteínas.Introduzca el coeficiente de extinción épsilon a 280 si se conoce; si el épsilon a 280 no se conoce, cálculelo utilizando el cálculo de épsilon a 280. Seleccione 0,2 milímetros en el control deslizante de longitud de trayecto para medir una muestra de tres microlitros. A continuación, en el software, haga clic en la pestaña configuración y seleccione la configuración de limpieza automática. Seleccione dos limpiezas para evitar cualquier contaminación cruzada y garantizar una lectura precisa.Para medir un blanco, pipete tres microlitros de agua o tampón sobre el pedestal y haga clic en blanco para la medición del blanco. A continuación, pipete cuidadosamente tres microlitros de la muestra de proteína sobre el pedestal. Sin introducir burbujas de aire, comience a medir la muestra haciendo clic en inicio en el software o presionando el botón de inicio en el instrumento.Repita la medición de la misma muestra tres veces para determinar la reproducibilidad mostrada. A continuación se presentan los datos obtenidos de mediciones realizadas en una muestra típica de ADN de doble cadena. La fórmula utilizada para calcular la concentración de ADN es: concentración de la muestra igual a DF multiplicado por la cantidad de OD 260 menos OD 320 multiplicado por NACF, donde DF equivale al factor de dilución de la muestra y NACF equivale al factor de concentración del ácido nucleico.El factor de concentración de ácidos nucleicos se establece de acuerdo con el analito seleccionado. Se indican la concentración calculada de ácido nucleico y la relación de OD 2 62 80. Esta tabla contiene los resultados de la prueba de reproducibilidad para la cuantificación de ADN.En conjunto, los datos muestran resultados altamente reproducibles, como se evidencia por la baja desviación estándar relativa del 0,26 %. Aquí se presentan resultados representativos de un análisis de concentración de proteína para BSA. La concentración de proteína en microgramos por mililitro se basa en el valor Epsilon two 80. Finalmente, esta tabla muestra un análisis de reproducibilidad de la cuantificación de proteínas.La desviación estándar relativa de 0,51 % indica que el BIOS spec nano mide la densidad óptica con precisión no solo para ADN, sino también para proteínas. Una vez dominado, se pueden analizar múltiples muestras en un minuto.

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Biología

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