Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

El objetivo general de este procedimiento es determinar con precisión y reproducibilidad las concentraciones de ácidos nucleicos y proteínas utilizando un espectrofotómetro de microvolumen. Esto se logra primero seleccionando la longitud de trayecto óptico adecuada para la muestra que se va a medir. El segundo paso del procedimiento consiste en medir un blanco.

A continuación, se mide la muestra de ADN o proteína. El paso final del procedimiento consiste en guardar los datos en formato PDF o CSV. En definitiva, resultados altamente reproducibles para ADN y proteína.

La cuantificación puede obtenerse rápida y con precisión mediante este método. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, precisa y reproducible. Para comenzar el procedimiento de cuantificación de ADN, encienda el espectrofotómetro BIOSpec-nano.

Abra el software BIOS spec nano desde el escritorio de la PC. Haga clic en la pestaña de ácido nucleico simple D-S-D-N-A. El software establecerá comunicación con el instrumento y ejecutará una secuencia de inicialización.

Esto verifica que el instrumento está funcionando de acuerdo con las especificaciones. A continuación, seleccione la longitud de trayecto. En el control deslizante de longitud de trayecto.

Hay tres opciones disponibles para muestras de volumen microlitro. Se pueden usar 0.2 milímetros o 0.7 milímetros. Y para muestras diluidas, existe la opción de utilizar una celda de trayecto de cinco milímetros.

En esta demostración, se selecciona 0,7 milímetros para medir una muestra de dos microlitros. Todos los cálculos se basan en la longitud de trayecto seleccionada. A continuación, en el software, haga clic en la pestaña de configuración y seleccione la configuración de limpieza automática.

Seleccione uno para una sola pasada. Antes de la medición de la muestra, o cada vez que se seleccione una nueva longitud de trayecto, se requiere una medición en blanco. Para una pipeta con longitud de trayecto de 0,7 milímetros, coloque dos microlitros de agua o tampón sobre el pedestal. Haga clic en blanco para realizar la medición en blanco.

La ventana superior se moverá para hacer contacto con la gota de muestra y se podrán observar destellos de xenón. Cuando la medición esté completa, el limpiador eliminará automáticamente la muestra. Ahora se puede medir la muestra.

Es importante utilizar una solución de muestra homogénea, ya que la presencia de partículas no disueltas puede afectar los resultados. Las partículas en la muestra darán lugar a datos irreproducibles. Para evitar la introducción de burbujas de aire, aspire cuidadosamente dos microlitros de la muestra y luego transfiera uniformemente la muestra desde la punta de la pipeta hacia el pedestal.

Pulse el botón de inicio del instrumento. Como antes, la ventana superior se moverá para hacer contacto con la gota de muestra y se pueden observar destellos de xenón; para determinar la reproducibilidad, repita la medición de la misma muestra tres veces. Todos los datos registrados se guardan automáticamente como un archivo A BUD. Para guardar como archivo P-D-F o CCSV, haga clic en guardar P-D-F-C-S-V.

Los resultados también se pueden guardar como un archivo CSV utilizando la selección adecuada en la pestaña de guardar. La cuantificación de proteínas se puede realizar mediante el método de absorbancia a 280. Para la cuantificación de proteínas, seleccione la pestaña de cuantificación de proteínas.

Introduzca el coeficiente de extinción épsilon a 280 si se conoce; si el épsilon a 280 no se conoce, cálculelo utilizando el cálculo de épsilon a 280. Seleccione 0,2 milímetros en el control deslizante de longitud de trayecto para medir una muestra de tres microlitros. A continuación, en el software, haga clic en la pestaña configuración y seleccione la configuración de limpieza automática. Seleccione dos limpiezas para evitar cualquier contaminación cruzada y garantizar una lectura precisa.

Para medir un blanco, pipete tres microlitros de agua o tampón sobre el pedestal y haga clic en blanco para la medición del blanco. A continuación, pipete cuidadosamente tres microlitros de la muestra de proteína sobre el pedestal. Sin introducir burbujas de aire, comience a medir la muestra haciendo clic en inicio en el software o presionando el botón de inicio en el instrumento.

Repita la medición de la misma muestra tres veces para determinar la reproducibilidad mostrada. A continuación se presentan los datos obtenidos de mediciones realizadas en una muestra típica de ADN de doble cadena. La fórmula utilizada para calcular la concentración de ADN es: concentración de la muestra igual a DF multiplicado por la cantidad de OD 260 menos OD 320 multiplicado por NACF, donde DF equivale al factor de dilución de la muestra y NACF equivale al factor de concentración del ácido nucleico.

El factor de concentración de ácidos nucleicos se establece de acuerdo con el analito seleccionado. Se indican la concentración calculada de ácido nucleico y la relación de OD 2 62 80. Esta tabla contiene los resultados de la prueba de reproducibilidad para la cuantificación de ADN.

En conjunto, los datos muestran resultados altamente reproducibles, como se evidencia por la baja desviación estándar relativa del 0,26 %. Aquí se presentan resultados representativos de un análisis de concentración de proteína para BSA. La concentración de proteína en microgramos por mililitro se basa en el valor Epsilon two 80. Finalmente, esta tabla muestra un análisis de reproducibilidad de la cuantificación de proteínas.

La desviación estándar relativa de 0,51 % indica que el BIOS spec nano mide la densidad óptica con precisión no solo para ADN, sino también para proteínas. Una vez dominado, se pueden analizar múltiples muestras en un minuto.