Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

El objetivo general de este procedimiento es examinar los cambios en la localización subcelular de proteínas tras la señalización por factores de crecimiento. Esto se logra primero inyectando blastómeros animales de embriones tempranos de Xenopus con ARN que codifican diversas proteínas fusionadas a RFP y el receptor de señalización FRIZZLED ocho. A continuación, se preparan implantes electrodrmicos y/o secciones criostáticas de embriones y se someten a inmunotinción.

Finalmente, las células inmunomarcadas se observan mediante un microscopio fluorescente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cómo la localización subcelular de proteínas específicas depende de las vías de señalización embrionarias. Como ejemplo, demostramos que Diversa es reclutada desde el centrosoma hacia la membrana celular por el receptor FRIZZLED ocho.

Este método permite a los investigadores visualizar la localización subcelular de proteínas de señalización in vivo utilizando embriones de Xenopus. Esto puede ayudar a abordar preguntas fundamentales en biología del desarrollo y biología celular, como los estudios sobre la regulación espacial de las señales y los mecanismos de prioridad celular. Para comenzar el proceso de fertilización in vitro, obtenga óvulos de ranas hembra que hayan sido inyectadas con gonadotropina coriónica humana.

Doce horas antes del experimento, agregue de 0,5 a un mililitro de solución de Ringer modificada de Marx 1 X sobre los huevos y fértilelos in vitro con un pequeño trozo de testículo diseccionado. Después de dos a tres minutos, reduzca la concentración de sal con MMR 0,1 X para activar la motilidad de los espermatozoides. Incube durante 20 minutos.

Tras la fertilización, los huevos se orientan con sus polos animales hacia arriba. Elimine la cubierta de gelatina de los huevos reemplazando la solución MMR con una solución de cisteína al 3 % en agua durante cinco minutos. Lave los huevos tres veces con MMR 0,1 X.

Incubar a 13 grados Celsius hasta la etapa de dos a cuatro células. Luego transferir los embriones a 3%fi. Incubar en 0,5 XMMR para microinyección.

Sintetice ARN a partir de moldes de ADN linealizados utilizando el kit M message M machine y dilúyalos con agua libre de ARN hasta una concentración de 0,1 a un microgramo por microlitro. Los ARN para diversos marcadores, como RFP, el marcador de membrana GFP CX y FRIZZLED ocho, se utilizan a una concentración de 0,1 a un nanogramo por inyección. Prepare las agujas de inyección a partir de tubos capilares utilizando un extractor de agujas y una muela para agujas antes de la inyección.

Calibre cada aguja con agua para expulsar 10 litros de líquido por inyección. Coloque los embriones encima de un recipiente de plástico en una gota grande de MMR 0,5 X al 3%. Aspire una microlitro de solución de ARN en una aguja de inyección con un microinyector Shige de punta estrecha.

Inyecte 10 nanolitros de ARN en cada uno de los dos blástulas animales de embriones de dos células. Transfiera los embriones inyectados a un pocillo de una placa de 12 pocillos e incube a 13 grados Celsius hasta que alcancen la etapa de gástrula temprana.

Transfiera los embriones en estadio gastro a una solución de 0,6 XMMR en un recipiente plástico de seis centímetros de diámetro recubierto con aeros al 1%. Retire manualmente la membrana vitelina con pinzas. Luego, utilice una aguja de tsin y un lazo de cabello para extirpar explantes de ectodermo de los embriones.

Fíjelos en formaldehído al 3,7 % en PBS durante 30 minutos. Lave el X explan tres veces durante 10 minutos cada vez en PBS. Para teñir los núcleos, agregue davi al tercer lavado.

A continuación, monte el explante X sobre un portaobjetos colocándolo entre dos tiras de cinta adhesiva, con la cara interna sin pigmento del explante X orientada hacia el objetivo. Añada de dos a tres gotas de 20 microlitros de la solución de montaje. Coloque un cubreobjetos encima.

Los embriones inyectados pueden ser seccionados por criomicrotomía para visualizar la distribución de las proteínas fluorescentes en la célula y para realizar tinción con anticuerpos específicos. En la etapa 10, fije los embriones durante una a dos horas a temperatura ambiente con fijador concentrado en un vial de vidrio de cuatro mililitros. A continuación, tras lavar con PBS, incluya los embriones en una solución de gelatina de pescado al 15% y sacarosa al 15% en el mismo vial.

Al día siguiente, transfiera los embriones incluidos a un molde de plástico. Congele rápidamente los embriones incluidos en hielo seco. Luego prepare secciones criostáticas utilizando un criostato.

Realice tinción inmunofluorescente en las secciones, monte las laminillas e image embriones seccionados transversalmente utilizando el mismo método descrito para los implantes de ectodermo. Recolecte las imágenes utilizando un microscopio fluorescente Zeiss Axio plan con los filtros adecuados y aome para identificar y obtener imágenes de planos Z específicos dentro del explante X. En esta figura, ersin se localiza en el centrosoma en células ectodérmicas, pero se translocaliza a la membrana celular.

En respuesta a Frizzled ocho, cex GFP marca la membrana celular en verde. Diverse en RFP aparece en rojo, y los núcleos marcados con DPI se observan en azul aquí. Diverse en RFP es reclutado a la membrana celular por Frizzled ocho en secciones criogénicas de embrión.

La tubulina gamma es un marcador centrosomal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la utilidad de los embriones y células embrionarias XUS para estudios de autorización de anclaje de proteínas y procesos de señalización a resolución subsidiaria.