Name: Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprende a visualizar la localización subcelular de proteínas en ectodermo de Xenopus mediante inyección de ARN y microscopía fluorescente. Este método permite estudiar la polaridad celular y el control espacial de señalización en biología del desarrollo.

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Investigación en el laboratorio Sokol es patrocinado por el institutos agregados Nacional de Salud.

1. Fertilización In Vitro de Xenopus huevos <ol><li> Obtener huevos de las ranas hembra que fueron inyectados con gonadotrofina coriónica humana (400 unidades / rana) 12 horas antes del experimento. </li><li> Coloque los huevos en una pequeña cantidad (0,5-1 ml) de 1 x Marc solución de Ringer modificadas (MMR) 10 a los huevos y fertilizar in vitro con un pequeño trozo de testículo disecado. Después de 2-3 minutos, añadir 0,1 x MMR para cubrir toda la superficie de los huevos. En 20 minutos, el huevo capa gelatinosa se elimina en un 3% cisteína - HCl (pH ajustado a 8 con hidróxido de sodio). Los huevos son lavados con 0,1 x MMR tres veces y se fue en una fría incubadora (13 ° C) para inyección. </li><li> Los huevos fertilizados se les permite desarrollarse a la etapa de células 2-4. Para las inyecciones, los embriones se transfieren a la solución que contiene 3% de Ficoll, 0,5 x MMR. </li></ol> 2. ARN microinyección <ol><li> ARN se sintetiza a partir de plantillas de ADN lineal con mMessage mMachine kit (Ambion) y se diluye con agua libre de RNasa en la concentración de acciones de 0,1-1 mg / l. Las dosis óptimas de ARN para la inyección son determinados en experimentos piloto. ARN para Diversin-RFP, el marcador de membrana GFP-CAAX Frizzled y 8 se utilizan en 0.1-1 ng por inyección. </li><li> Agujas de inyección se preparan con un extractor de la aguja de un capilar y luego con un molinillo de aguja. Antes de la inyección, cada aguja se calibra con agua para expulsar 10 nl de inyección de líquido por habitante. </li><li> Para las inyecciones, los embriones se colocan en un plato de plástico en una gran gota de 3% Ficoll, 0,5 x MMR. Un microlitro de solución de ARN se aspira en una aguja de inyección con Narishige microinyector. 10 nl de ARN se inyecta en animales de 8 blastómeros de embriones de células 2-3 veces. Los embriones inyectados se transfieren a un pozo de la placa de 12 pocillos. </li></ol> 3. Preparación de explantes ectodérmica <ol><li> Cuando los embriones inyectados llegar a las primeras etapas de gástrula, se transfieren a 0,6 x solución de MMR en un plato de 3 cm de plástico recubiertas con agarosa al 1%. Membrana vitelina se elimina manualmente con un par de pinzas. Explantes ectodérmica son extirpados de los embriones con una aguja de tungsteno y un hairloop. </li><li> Explantes ectodérmica se transfieren a un frasco de vidrio y se fija con 3,7% de formaldehído en tampón fosfato salino (PBS) durante 30 minutos. Explantes fija se lavan tres veces con PBS (10 minutos cada uno). DAPI se incluye en el tercer lavado para teñir los núcleos. </li><li> Los explantes se montan en un portaobjetos de vidrio. Dos tiras de cinta adhesiva se unen a la diapositiva y los explantes se colocan entre las dos bandas. Puesto que la superficie exterior de los explantes se pigmenta, la parte interna de los explantes debe mirar hacia el objetivo del microscopio. Añadir dos-tres 20 gotas l de la solución de montaje (70% de glicerol en PBS como 25 mg / ml DABCO, anti-fading reactivo) 11. Ponga un cubreobjetos en la parte superior. </li></ol> 4. Imágenes de explantes bajo un microscopio fluorescente <ol><li> Las muestras son examinadas bajo microscopio Zeiss Axioplan fluorescente con filtros adecuados. </li><li> Las imágenes son tomadas con el archivo adjunto apótoma de visualizar un plano específico de varios explantes independiente. </li></ol> 5. Muestras criostáticas Muestras criostáticas es una forma alternativa de visualizar la distribución de las proteínas fluorescentes en la célula y más aplicable para inmunotinción. En la 10 ª etapa, los embriones son fijos durante 1-2 horas con el fijador de Dent (20% DMSO, 80% de metanol), se lava con PBS, y embebidos en una solución de sacarosa al 15% de pescado gelatin/15 11%. Los embriones son incorporados rápidamente congelado en hielo seco y cryosections se generan en el criostato Leica. Las secciones transversales se incluyen las células ectodérmicas que heredan ARN inyectada y sus productos proteicos traducido. Las secciones de mantener la fluorescencia y se immunostained con anticuerpos específicos y con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Los medios de montaje son las mismas que las descritas anteriormente. Imágenes se pueden realizar como se describe anteriormente. 6. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Receptor rizado reclutas Diversin a la membrana celular. Ectodermo células que expresan Frizzled 8 (Xfz8) y ARN Div-RFP revelan Div-RFP en la membrana celular, en lugar del centrosoma (según lo revelado por g-tubulina co-tinción). El esquema del experimento es en la parte superior, una sección transversal típica se muestra.

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Developmental+Genetics%22">Principles of Developmental Genetics</a>. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%3A+multiple+pathways%2C+multiple+receptors%2C+and+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li>
<li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt%2FJNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li>
<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
<li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li>
<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li>
<li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li>
</ol>

Hemos utilizado el protocolo anterior para caracterizar la localización subcelular de Diversin. En los explantes de polo animal, Diversin-RFP se detectó al lado del núcleo y colocalized con g-tubulina, un marcador centrosomal, en cryosections (Figura 1). Una vez que la localización subcelular de una proteína se identifica, supresión construcciones se pueden generar para establecer dominios de la proteína que son necesarias y suficientes para la localización subcelular. Con este enfoque, los dominios de la localización d...

translocación polarizado de proteínas fluorescentes en xenopus ectodermo en respuesta a la señalización de wnt

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Polaridad celular es una propiedad fundamental de las células eucariotas que es dinámica regulada por factores tanto intrínsecos como extrínsecos durante el desarrollo embrionario de 1, 2. Una de las vías de señalización implicadas en el presente Reglamento es la vía Wnt, que se utiliza muchas veces durante la embriogénesis y la crítica de la enfermedad humana 3, 4, 5. Múltiples componentes moleculares de esta vía de señalización de forma coordinada regular de manera espacialmente restringida, pero los mecanismos subyacentes no se comprenden totalmente. Xenopus células epiteliales embrionarias es un excelente sistema para estudiar la localización subcelular de las diferentes proteínas de señalización. Las proteínas fluorescentes de fusión se expresan en los embriones de Xenopus por microinyección de ARN, los explantes ectodérmica se preparan y localización de la proteína es evaluada por epifluorescencia. En este protocolo experimental se describe cómo la localización subcelular de Diversin, una proteína citoplasmática que se ha implicado en la señalización celular y la determinación de la polaridad de 6, 7 se visualiza en Xenopus células ectodérmicas para estudiar la transducción de señales Wnt 8. Co-expresión de un ligando Wnt o un receptor Frizzled altera la distribución de Diversin fusionada con la proteína fluorescente de color rojo, RFP, y recluta a la membrana celular de una manera polarizada 8, 9. Este protocolo ex vivo debe ser una adición útil a los estudios in vitro de células de mamífero cultivadas, en el que el control espacial de la señalización difiere de la del tejido intacto y es mucho más difícil de analizar.

Ectodermo embrionario de Xenopus se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de la polaridad celular. Un ensayo se describe, en el que la distribución subcelular de las proteínas fluorescentes se evalúa en las células de ectodermo. Este protocolo ayudará a contestar preguntas relacionadas con el control espacial de la señalización.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

La polaridad celular es una propiedad fundamental de las células eucariotas que es regulada dinámicamente por factores tanto intrínsecos como extrínsecos durante el desarrollo embrionario...

El objetivo general de este procedimiento es examinar los cambios en la localización subcelular de proteínas tras la señalización por factores de crecimiento. Esto se logra primero inyectando blastómeros animales de embriones tempranos de Xenopus con ARN que codifican diversas proteínas fusionadas a RFP y el receptor de señalización FRIZZLED ocho. A continuación, se preparan implantes electrodrmicos y/o secciones criostáticas de embriones y se someten a inmunotinción.Finalmente, las células inmunomarcadas se observan mediante un microscopio fluorescente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cómo la localización subcelular de proteínas específicas depende de las vías de señalización embrionarias. Como ejemplo, demostramos que Diversa es reclutada desde el centrosoma hacia la membrana celular por el receptor FRIZZLED ocho.Este método permite a los investigadores visualizar la localización subcelular de proteínas de señalización in vivo utilizando embriones de Xenopus. Esto puede ayudar a abordar preguntas fundamentales en biología del desarrollo y biología celular, como los estudios sobre la regulación espacial de las señales y los mecanismos de prioridad celular. Para comenzar el proceso de fertilización in vitro, obtenga óvulos de ranas hembra que hayan sido inyectadas con gonadotropina coriónica humana.Doce horas antes del experimento, agregue de 0,5 a un mililitro de solución de Ringer modificada de Marx 1 X sobre los huevos y fértilelos in vitro con un pequeño trozo de testículo diseccionado. Después de dos a tres minutos, reduzca la concentración de sal con MMR 0,1 X para activar la motilidad de los espermatozoides. Incube durante 20 minutos.Tras la fertilización, los huevos se orientan con sus polos animales hacia arriba. Elimine la cubierta de gelatina de los huevos reemplazando la solución MMR con una solución de cisteína al 3 % en agua durante cinco minutos. Lave los huevos tres veces con MMR 0,1 X.Incubar a 13 grados Celsius hasta la etapa de dos a cuatro células. Luego transferir los embriones a 3%fi. Incubar en 0,5 XMMR para microinyección.Sintetice ARN a partir de moldes de ADN linealizados utilizando el kit M message M machine y dilúyalos con agua libre de ARN hasta una concentración de 0,1 a un microgramo por microlitro. Los ARN para diversos marcadores, como RFP, el marcador de membrana GFP CX y FRIZZLED ocho, se utilizan a una concentración de 0,1 a un nanogramo por inyección. Prepare las agujas de inyección a partir de tubos capilares utilizando un extractor de agujas y una muela para agujas antes de la inyección.Calibre cada aguja con agua para expulsar 10 litros de líquido por inyección. Coloque los embriones encima de un recipiente de plástico en una gota grande de MMR 0,5 X al 3%. Aspire una microlitro de solución de ARN en una aguja de inyección con un microinyector Shige de punta estrecha.Inyecte 10 nanolitros de ARN en cada uno de los dos blástulas animales de embriones de dos células. Transfiera los embriones inyectados a un pocillo de una placa de 12 pocillos e incube a 13 grados Celsius hasta que alcancen la etapa de gástrula temprana.Transfiera los embriones en estadio gastro a una solución de 0,6 XMMR en un recipiente plástico de seis centímetros de diámetro recubierto con aeros al 1%. Retire manualmente la membrana vitelina con pinzas. Luego, utilice una aguja de tsin y un lazo de cabello para extirpar explantes de ectodermo de los embriones.Fíjelos en formaldehído al 3,7 % en PBS durante 30 minutos. Lave el X explan tres veces durante 10 minutos cada vez en PBS. Para teñir los núcleos, agregue davi al tercer lavado.A continuación, monte el explante X sobre un portaobjetos colocándolo entre dos tiras de cinta adhesiva, con la cara interna sin pigmento del explante X orientada hacia el objetivo. Añada de dos a tres gotas de 20 microlitros de la solución de montaje. Coloque un cubreobjetos encima.Los embriones inyectados pueden ser seccionados por criomicrotomía para visualizar la distribución de las proteínas fluorescentes en la célula y para realizar tinción con anticuerpos específicos. En la etapa 10, fije los embriones durante una a dos horas a temperatura ambiente con fijador concentrado en un vial de vidrio de cuatro mililitros. A continuación, tras lavar con PBS, incluya los embriones en una solución de gelatina de pescado al 15% y sacarosa al 15% en el mismo vial.Al día siguiente, transfiera los embriones incluidos a un molde de plástico. Congele rápidamente los embriones incluidos en hielo seco. Luego prepare secciones criostáticas utilizando un criostato.Realice tinción inmunofluorescente en las secciones, monte las laminillas e image embriones seccionados transversalmente utilizando el mismo método descrito para los implantes de ectodermo. Recolecte las imágenes utilizando un microscopio fluorescente Zeiss Axio plan con los filtros adecuados y aome para identificar y obtener imágenes de planos Z específicos dentro del explante X. En esta figura, ersin se localiza en el centrosoma en células ectodérmicas, pero se translocaliza a la membrana celular.En respuesta a Frizzled ocho, cex GFP marca la membrana celular en verde. Diverse en RFP aparece en rojo, y los núcleos marcados con DPI se observan en azul aquí. Diverse en RFP es reclutado a la membrana celular por Frizzled ocho en secciones criogénicas de embrión.La tubulina gamma es un marcador centrosomal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la utilidad de los embriones y células embrionarias XUS para estudios de autorización de anclaje de proteínas y procesos de señalización a resolución subsidiaria.

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