Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

El objetivo de este procedimiento es determinar el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de especies reactivas de oxígeno en las neuronas corticales primarias utilizando las sondas fluorescentes, TMRM y H 2D CFD respectivamente. Esto se logra preparando primero las concentraciones de stock y trabajo del TMRM y el CFDA H 2D. El segundo paso es incubar las neuronas corticales con TMRM y H 2D CFDA a temperatura ambiente durante 45 minutos en tampón de carreteras tailandesas.

El tercer paso es obtener imágenes de la intensidad de fluorescencia de TMRM y DCF en neuronas corticales vivas utilizando una emisión de excitación de 5, 15, 5, 17 nanómetros y 4 88, 5 15 nanómetros, respectivamente. Los cambios en la TMR en la fluorescencia se controlarán en presencia del unco FCCP mitocondrial, mientras que los cambios en la fluorescencia del DCF se controlarán en presencia de peróxido de hidrógeno. El paso final de este procedimiento es la recopilación, normalización y análisis de datos.

En última instancia, los resultados se obtienen trazando un gráfico que muestra los niveles relativos de intensidad de fluorescencia de TMRM y DCF antes y después del tratamiento con FCCP y peróxido de hidrógeno, respectivamente. Hola, soy Joanna Koska. Bienvenidos a mi laboratorio en la Universidad Loyola de Chicago.

Hoy te mostraremos cómo medir el potencial de la membrana mitocondrial y las especies reactivas de oxígeno en las neuronas corticales de rata. El procedimiento será demostrado por dhi. Hola, soy de Denise Jossi.

Con este procedimiento, el potencial de membrana mitocondrial se puede medir en una sola etiqueta mitocondrial y las especies reactivas de oxígeno en la etiqueta de una sola célula. Así que comencemos. Prepare un stock de 10 milimolares de TMRM disolviendo cinco miligramos de TMRM en un mililitro de vórtice de óxido de dimetilsulfo anhidro durante un minuto.

Luego haga alícuotas, almacene las alícuotas a menos 20 grados centígrados. Proteger de la luz y utilizar en el plazo de un mes. A continuación, prepare un caldo de 10 milimolares de H 2D CFDA disolviendo 4,87 miligramos de H 2D CFDA en un mililitro de óxido de dimetilsulfo anhidro.

Del mismo modo, haga vórtice durante un minuto, luego haga alícuotas y guárdelas a menos 20 grados centígrados. Protéjalo de la luz y úselo dentro de una semana para cargar primero las neuronas corticales de la rata con TMRM. Lave las neuronas cultivadas tres veces con el tampón de tiro.

A continuación, prepare 20 nano molares de TMRM diluyendo el caldo de 10 milimolares de TMRM 1000 veces en tb. A continuación, añada dos microlitros de TMRM diluido por cada mililitro de tb. Incubar las neuronas con TMRM durante 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

Después de 45 minutos, monte la placa de cultivo en la platina del microscopio y comience a tomar imágenes para cargar las neuronas corticales de rata con H 2D CFDA, lave las neuronas cultivadas tres veces con tb. A continuación, prepare dos micromolares de H 2D CFDA diluyendo el stock de 10 milimolares de H 2D CFDA 10 veces en tb. Y luego agregue dos microlitros de H 2D CFDA diluido por un mililitro de tb.

A continuación, incubar las neuronas con H 2D CFDA durante 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente después de 45 minutos. Se utiliza lavar las neuronas cuatro veces con TB para eliminar el exceso de indicador fluorescente antes de obtener imágenes para realizar imágenes en vivo de las neuronas incubadas con microscopía de escaneo láser confocal TMRM con la aplicación de un programa de series de tiempo en vivo. Aplique baja resolución y potencia láser atenuada para minimizar el tiempo necesario para obtener imágenes y evitar el blanqueo de fotos.

A continuación, ajuste el enfoque de las neuronas montadas cargadas con TMRM utilizando luz reflejada. Examine la fluorescencia de TMRM mediante iluminación a cinco 14 nanómetros y detección a cinco 70 nanómetros. Establezca la ganancia de detección de la cámara justo por debajo del nivel de saturación una vez que se hayan establecido todos los parámetros, que incluyen la resolución, la detección de potencia láser, la ganancia de la cámara y el intervalo de lapso de tiempo para obtener imágenes.

No cambies esta configuración entre experimentos. A continuación, cambie el campo. Comience a recopilar imágenes para probar los cambios en el estímulo delta PSY M, como se puede aplicar un micromolar de FCCP o dos microgramos por mililitro de oligomicina, lo que despolarizará o hiperpolarizará significativamente el potencial de la membrana mitocondrial respectivamente.

Estos cambios se reflejarán en una disminución de la intensidad de la fluorescencia de la TMRM en comparación con la intensidad de fluorescencia basal en el caso del FCCP o en un aumento de la intensidad de la fluorescencia de la TMRM. En el caso de un LIGA myin sin realizar imágenes en vivo de las neuronas incubadas con H 2D CFDA, primero monte la placa de cultivo en la platina de un microscopio, ajuste el enfoque de las células utilizando la luz reflejada. Examine la fluorescencia DCF por excitación a 4 88 nanómetros y emisión a cinco 15 nanómetros.

A continuación, ajuste la potencia del láser a cinco a 7%detecte una ganancia y resolución de 2 56 por 2 56. No cambies esta configuración entre experimentos. A continuación, establezca la frecuencia para obtener imágenes en directo.

Con el programa Series temporales, seleccione un nuevo campo y comience a adquirir imágenes para detectar cambios en los niveles de R OS. Trate las células con 100 a 200 micromolares de peróxido de hidrógeno. Esto se reflejará en un aumento en la intensidad de fluorescencia de DCF en comparación con el nivel basal.

Utilice la herramienta región de interés del programa LSM para seleccionar las áreas. A continuación, seleccione los ROI de las regiones mitocondriales o los ROI de todo el cuerpo celular en las células de imagen. Para medir las intensidades de fluorescencia de TMRM o ROS respectivamente.

Seleccione las regiones junto a las celdas. Para calcular la intensidad de fluorescencia de fondo, realice varias mediciones y, para calcular la intensidad media de fondo, reste la intensidad media de la fluorescencia de fondo de las intensidades de fluorescencia medias de las regiones de interés de cada celda para cada punto de tiempo utilizando Microsoft Excel. Después de restar la intensidad de fondo, normalice la intensidad de fluorescencia TMRM o DCF a la fluorescencia de referencia.

Usando esta fórmula, luego use el programa de diagramas Sigma para generar el gráfico que muestra los cambios en la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo. Aquí hay un ejemplo de una imagen de fluorescencia de neuronas corticales de rata incubadas con TMRM. La adición de unco mitocondrial F-C-C-P-A conduce a la despolarización mitocondrial y a una pérdida de la intensidad de la fluorescencia de TMRM.

El nivel basal de fluorescencia de TMRM permanece estable antes de la adición de FCCP. El análisis cuantitativo de los cambios en la fluorescencia de TMRM a lo largo del tiempo muestra una disminución significativa en la fluorescencia de TMRM después de la adición de FCCP. Este es un ejemplo de una imagen de fluorescencia de neuronas corticales de rata cargadas con DCF.

El nivel de fluorescencia DCF de referencia permanece sin cambios en los primeros 120 segundos antes de la aplicación de peróxido de hidrógeno. La adición de peróxido de hidrógeno da como resultado un aumento en la intensidad de la fluorescencia de DCF en los cuerpos celulares. Las mediciones de lapso de tiempo de la fluorescencia DCF muestran sus niveles constantes, que han aumentado después de los tratamientos con peróxido de hidrógeno.

En este procedimiento, es importante recordar utilizar una potencia láser baja y una velocidad de escaneo rápida para evitar los artefactos del fotoblanqueo y la fototoxicidad. Ten buena suerte con tu experimento.