Name: Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprende a medir el potencial de membrana mitocondrial y especies reactivas de oxígeno en neuronas corticales de rata usando sondas fluorescentes TMRM y H2DCFDA. Este método permite evaluar dinámicas celulares en tiempo real.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (K22NS050137 a JCB).

1. De cultivo celular <ol><li> Las neuronas corticales son aisladas y cultivadas con técnicas descritas anteriormente y se cultivaron en placas de cultivo con fondo de cristal (MatTek Corporation, Ashland, MA), recubierta con poli-D-lisina y laminina 1. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones madre de los fluorescentes TMRM sondas y H 2 DCF-DA <ol><li> Preparar una solución de 10 mM de TMRM disolviendo 5,0 mg de TMRM en 1 ml de dimetilsulfóxido anhidro. Vortex durante 1 min. Entonces, hacer alícuotas y almacenarlos a -20 ° C, protegido de la luz, y su uso dentro de un mes. </li><li> A continuación, preparar una solución de 10 mM de H 2 DCF-DA mediante la disolución de 4,87 mg de H 2 DCF-DA en 1 ml de DMSO anhidro. Del mismo modo, vortex durante 1 min. Entonces, hacer alícuotas y almacenarlos a -20 ° C, protegido de la luz, y su uso dentro de una semana. </li></ol> 3. Cargando corticales de rata neuronas con TMRM y H 2 DCF-DA TMRM es un potenciómetro, penetran en las células indicador fluorescente que se acumula en el interior de alta carga negativa de las mitocondrias. Es importante la utilización de las bajas concentraciones (10-50 nm de rango) de TMRM para evitar la auto-extinción de TMRM mitocondrial. Luego, la señal de fluorescencia de TMRM pueden ser directamente relacionados con la co-ΔΨm través de la membrana mitocondrial interna. Una pérdida de ΔΨm causas TMRM de fuga de la mitocondria que resulta en una pérdida de intensidad de fluorescencia. H 2 DCF-DA se penetra en las células de la sonda convierte en DCF-DA por las esterasas intracelulares, y sus resultados en la oxidación de DCF fluorescente. La concentración final de H 2 DCF-DA oscila entre 2.10 M y que debe ser probado empíricamente en neuronas derivadas de las diferentes regiones del cerebro ya que las altas concentraciones de carga podría dar lugar a la saturación de fluorescencia de DCF, incluso en ausencia de H 2 O 2. La presencia de oxidantes endógenos o exógenos (por ejemplo, el óxido nítrico peróxido de hidrógeno) se incrementará la intensidad de fluorescencia DFC. A continuación, ofrecemos un protocolo para la carga de las neuronas corticales de rata con TMRM y H 2 DCF-DA. <ol><li> Para cargar las neuronas corticales de rata con TMRM, en primer lugar, lavar los cultivos de neuronas 3 veces con tampón de Tyrode (superposición de texto: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucosa, 1,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, y 10 mM HEPES, ajustar el pH a 7,4 con NaOH). A continuación, preparar 20 nM de TMRM diluyendo el stock de 10 mM TMRM 1 / 1000 veces la tuberculosis y después agregue 2 l de TMRM diluidas por 1 ml de la tuberculosis. Incubar las neuronas con TMRM durante 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de 45 minutos, coloque la placa de cultivo en la platina del microscopio y empezar de imágenes. </li><li> Para cargar las neuronas corticales de rata con H 2 DCF-DA, lavar los cultivos de neuronas 3 veces con la tuberculosis. A continuación, preparar 2 M de H 2 DCF-DA mediante la dilución de los 10 mm de H 2 DCF-DA stock 1 / 10 veces en la tuberculosis y después agregue 2 l de diluirse H 2 DCF-DA por 1 ml de TB. A continuación, se incuban las neuronas con H 2 DCF-DA durante 45 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Después de 45 minutos, lavar las neuronas 4 veces con TB para eliminar el exceso de indicador fluorescente antes de obtener las imágenes. </li></ol> 4. Imágenes en directo de las neuronas se incubaron con TMRM para determinar ΔΨm <ol><li> Para realizar las imágenes en directo de las neuronas se incubaron con TMRM, la microscopía de escaneo láser confocal (superposición de texto: LSM 510, Carl Zeiss, Inc.), con la aplicación de vivir de series de tiempo del programa, se utiliza. Aplicar de baja resolución y atenuado la potencia del láser (superposición de texto: baja resolución: 256 x 256, la potencia del láser: 1%) para reducir al mínimo el tiempo necesario para obtener imágenes y para evitar photobleaching. </li><li> . A continuación, ajustar el enfoque de las neuronas montado cargado con TMRM con la luz reflejada. Examine la fluorescencia TMRM por la iluminación a 514 nm y la detección a 570 nm. Ajustar la ganancia de la detección de una cámara debajo del nivel de saturación. </li><li> Una vez que todos los parámetros que incluyen la resolución, la potencia del láser, el aumento de la detección de una cámara, y el intervalo de tiempo transcurrido para obtener las imágenes se establecen, no cambian estos valores entre los experimentos. A continuación, cambie el campo. Comenzar a recoger las imágenes. </li><li> Para probar los cambios en ΔΨm, estímulos, tales como una M de FCCP o 2 mg / ml de oligomicina, se puede aplicar, lo cual permitirá despolarización o hiperpolarización del potencial de membrana mitocondrial, respectivamente. Estos cambios se reflejarán en una disminución en la intensidad de fluorescencia TMRM en comparación con la intensidad de fluorescencia de referencia en el caso del FCCP, o un aumento en la intensidad de fluorescencia TMRM en el caso de oligomicina. </li></ol> 5. Imágenes en vivo de neuronas incubadas con H 2 DCF-DA para determinar ROS <ol><li> Para realizar las imágenes en directo de las neuronas incubadas con H 2 DCF-DA, en primer lugar, montar la placa de cultivo en el escenario de un microscopio. Ajustar el enfoque de las células que nosción refleja la luz. Examine DCF de fluorescencia de excitación a 488 nm y emisión a 515 nm. </li><li> A continuación, ajustar la potencia del láser a un 5-7%, la ganancia del detector, y resolución de 256 x 256. No cambie estos ajustes entre los experimentos. A continuación, establezca la frecuencia para la obtención de imágenes en directo mediante el programa de series de tiempo. </li><li> Seleccione un nuevo campo y comenzar a adquirir las imágenes. Para detectar cambios en los niveles de ROS, tratar las células con 100 a 200 M de H 2 O 2. Esto se refleja en un aumento en la intensidad de fluorescencia de DCF en comparación con el nivel de referencia. </li></ol> 6. Análisis de los datos <ol><li> Use la región de interés (Superposición de texto: ROI) de herramientas del programa de LSM para seleccionar las áreas. A continuación, medir la intensidad de ROS TMRM o fluorescencia. Seleccione el ROI de las regiones mitocondriales o regiones de interés desde el cuerpo celular en las células de todo imágenes para medir la intensidad de fluorescencia de TMRM o ROS, respectivamente. </li><li> Calcular la intensidad media de fluorescencia de todas las regiones de interés de cada célula de TMRM o de los cuerpos de célula entera para todas las células de imágenes de ROS para cada momento. Seleccione las regiones próximas a las células para calcular la intensidad de fluorescencia de fondo. Tomar varias mediciones y calcular la intensidad media de fondo. </li><li> Restar la intensidad de fluorescencia de fondo promedio de intensidad de fluorescencia media de rendimiento de la inversión en cada celda para cada momento el uso de Microsoft Excel. Después de restar la intensidad de fondo, normalizar la intensidad de fluorescencia de DCF o TMRM a la fluorescencia basal mediante esta fórmula (superposición de texto: Df = FF o / F o x 100, donde F = intensidad de la fluorescencia en cualquier punto del tiempo, para = línea de base de fluorescencia). A continuación, utilice el programa Sigma Plot para generar el gráfico que muestra los cambios en la intensidad de la fluorescencia con el tiempo. </li></ol> 7. Resultados representante La figura 1A muestra una imagen de fluorescencia de las neuronas corticales de rata incubados con TMRM. Además del FCCP, un desacoplador mitocondrial, conduce a la despolarización mitocondrial y una pérdida de intensidad de fluorescencia TMRM (Fig. 1B). El nivel básico TMRM fluorescencia se mantiene estable antes de la adición de FCCP (los primeros 350 segundos;. Fig. 1C). El análisis cuantitativo de TMRM cambios de fluorescencia en el tiempo muestra una disminución significativa de la fluorescencia TMRM tras la adición de FCCP (Fig. 1C). Figura 1D muestra la imagen de fluorescencia de las neuronas corticales de rata cargado con DCF. Además de H 2 O 2 da como resultado una mayor intensidad de fluorescencia de DCF en los cuerpos celulares (Fig. 1E). La línea de base DCF nivel de fluorescencia no se ha modificado (los primeros 120 segundos) antes de la aplicación de H 2 O 2. Lapso de tiempo-las medidas de fluorescencia de DCF muestran sus niveles estables, lo que aumenta después de H 2 O 2 tratamiento (Fig. 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Evaluación del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de ROS en las neuronas corticales de rata viva. (A) Imagen Representante de fluorescencia de las neuronas corticales cargado con TMRM. Después de escanear la línea de base TMRM fluorescencia, las neuronas fueron tratadas con el FCCP protonophore (1 M). A la derecha hay una barra de intensidad de la fluorescencia pseudocolor TMRM con un máximo de brillantes que representan a amarillo y negro y la intensidad mínima, respectivamente. La pérdida de fluorescencia TMRM de las regiones mitocondrial indica el colapso de ΔΨm a FCCP tratamiento (grupo B). La representación cuantitativa de los cambios en la intensidad de fluorescencia TMRM en diferentes momentos antes y después del tratamiento FCCP se muestra en el panel C. (D) Imagen de fluorescencia de las neuronas corticales de rata cargado con H2DCF-DA. Después de determinar la base de DCF de fluorescencia, las células fueron tratadas con 200 mM H 2 O 2, y el cambio en la fluorescencia de DCF se evaluó. Un aumento en la fluorescencia de DCF refleja el aumento en los niveles de ROS en H 2 O 2 tratamiento (E). El análisis cuantitativo de los cambios en la fluorescencia de DCF, antes y después de H 2 O 2 tratamiento, se muestra en el panel de F. barra de escala = 10 m Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi En vivo de imágenes de células en las neuronas corticales TMRM antes y después de la adición FCCP con objetivo de 40X. La intensidad de pseudocolor muestra un máximo (de color amarillo brillante, antes de añadir FCCP) y la disminución (de color rojo, después de la adición FCCP) la intensidad de fluorescencia después de la adición TMRM FCCP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Haga clic aquí para ver el video</a> Vídeo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi En vivo de imágenes de células de DCF en las neuronas corticales antes y después de H 2 O 2 además con objetivo de 40X. La línea de base DCF fluorescencia de color verde claro en los cuerpos celulares y H2O2 Además aumenta la DCF intensidad de la fluorescencia de color verde brillante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">Haga clic aquí para ver el video</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

Hemos presentado un procedimiento paso a paso describe cómo determinar ΔΨm y ROS en ratas las neuronas corticales con el fluorescente TMRM indicadores y H 2 DCF-DA, respectivamente. Para otros tipos de células, es importante para determinar empíricamente la concentración final y el tiempo de carga de TMRM o H 2 DCF-DA. En general, la gama de concentraciones de 20 a 200 nM TMRM, y el tiempo de incubación de células con TMRM varía de 20 a 60 min. La concentración final de H 2 DCF-DA varía desde 2 hasta 10 M, y la incubación de las células en una solución de carga que contiene este indicador varía entre 30-45 minutos. Es importante para optimizar la potencia del láser y la velocidad de escaneo de tomar las imágenes para evitar tanto la foto-toxicidad para las células y cambios en la intensidad de fluorescencia (por ejemplo, el parpadeo de TMRM fluorescencia) en ausencia de cualquier estímulo. Los ajustes ópticos optimizados debería resultar en una señal de fluorescencia que no es mayor o menor saturación (umbral) en ausencia de estímulo. Las condiciones óptimas para recoger las imágenes de un campo seleccionado en una potencia del láser en particular y una velocidad de escaneado se logra cuando no hay cambios en la intensidad de la fluorescencia de la sonda en la ausencia de cualquier estímulo durante 10-15 minutos de imágenes en vivo. Otras sondas de fluorescencia para determinar ΔΨm incluyen rodamina 123 y tetra metil éster etílico rodamina (TMRE). Sin embargo, se encontró que inhibe los procesos respiratorios en dos mitocondrias aisladas. Es importante destacar que TMRM no tiene ningún efecto sobre la respiración mitocondrial en bajas concentraciones y tiene dos bajas y fototoxicidad photobleaching 3 en comparación con otras sondas. H 2 DCF-DA es un buen indicador de ROS como es bien retenido en las células y reconoce varias especies oxidantes, como peróxidos, óxidos de super, y el óxido nítrico 4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Con fondo de cristal cultura plato </td><td> MatTek Corporación </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl2 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

determinación de especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) es fundamental para mantener la función fisiológica de la cadena respiratoria para generar ATP. Una pérdida significativa de ΔΨm hace agotadas las células de la energía con la posterior muerte. Las especies reactivas del oxígeno (ROS) son importantes moléculas de señalización, pero su acumulación en condiciones patológicas conduce a estrés oxidativo. Las dos principales fuentes de ROS en las células son las toxinas ambientales y el proceso de fosforilación oxidativa. Disfunción mitocondrial y de estrés oxidativo han sido implicados en la fisiopatología de muchas enfermedades, por lo tanto, la capacidad de determinar ΔΨm y ROS pueden proporcionar pistas importantes sobre el estado fisiológico de la célula y la función de la mitocondria. Varias sondas fluorescentes (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1) se puede utilizar para determinar Δψm en una variedad de tipos celulares, y muchos indicadores de fluorescencia (dihydroethidium, dihidrorodamina 123, H 2 DCF-DA) se puede utilizar para determinar ROS . Casi todas las sondas de fluorescencia que se utilizan para evaluar ΔΨm o ROS son de una sola longitud de onda de los indicadores, que aumentan o disminuyen su intensidad de fluorescencia proporcional a un estímulo que aumenta o disminuye los niveles de ΔΨm o ROS. Por lo tanto, es imprescindible para medir la intensidad de la fluorescencia de las sondas a nivel basal y después de la aplicación de un estímulo específico. Esto permite determinar el porcentaje de cambio en la intensidad de fluorescencia entre el nivel de referencia y un estímulo. Este cambio en la intensidad de la fluorescencia refleja el cambio en los niveles relativos de ΔΨm o ROS. En este video, que muestra cómo aplicar el indicador de fluorescencia, TMRM, en ratas las neuronas corticales para determinar el porcentaje de cambio en la intensidad de fluorescencia TMRM entre el nivel basal y después de aplicar FCCP, un desacoplador mitocondrial. Los niveles más bajos de TMRM fluorescencia que resulta del tratamiento FCCP reflejan la despolarización del potencial de membrana mitocondrial. También se muestra cómo aplicar la fluorescencia de la sonda H 2 DCF-DA para evaluar el nivel de ROS en las neuronas corticales, en primer lugar al inicio del estudio y después de la aplicación de H 2 O 2. Este protocolo (con modificaciones menores) también se puede utilizar para determinar los cambios en ΔΨm y ROS en diferentes tipos celulares y en neuronas aisladas de otras regiones del cerebro.

Se demuestra la aplicación del indicador de fluorescencia, TMRM, en las neuronas corticales para determinar los cambios relativos en la intensidad de fluorescencia TMRM antes y después de la aplicación de un estímulo específico. También muestran la aplicación de la fluorescencia de la sonda H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA para evaluar el nivel relativo de especies reactivas del oxígeno en las neuronas corticales.

Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

El potencial de membrana mitocondrial (&Delta;&Psi;m) es fundamental para mantener la función fisiológica de la cadena respiratoria para generar ATP. Un ...

El objetivo de este procedimiento es determinar el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de especies reactivas de oxígeno en neuronas corticales primarias utilizando las sondas fluorescentes TMRM y H2DCFDA, respectivamente. Esto se logra primero preparando las concentraciones stock y de trabajo de TMRM y H2DCFDA. El segundo paso consiste en incubar las neuronas corticales con TMRM y H2DCFDA a temperatura ambiente durante 45 minutos en tampón Thai roads.El tercer paso consiste en obtener imágenes de la intensidad de fluorescencia de TMRM y DCF en neuronas corticales vivas utilizando excitación y emisión de 515/517 nanómetros y 488/515 nanómetros, respectivamente. Los cambios en la fluorescencia de TMR se monitorearán en presencia del desacoplador mitocondrial FCCP, mientras que los cambios en la fluorescencia de DCF se monitorearán en presencia de peróxido de hidrógeno. El paso final de este procedimiento es la recopilación, normalización y análisis de los datos.En última instancia, los resultados se obtienen mediante la elaboración de una gráfica que muestra los niveles relativos de intensidad de fluorescencia de TMRM y DCF antes y después del tratamiento con FCCP y peróxido de hidrógeno, respectivamente. Hola, soy Joanna Koska. Bienvenidos a mi laboratorio en la Universidad Loyola de Chicago.Hoy les mostraremos cómo medir el potencial de membrana mitocondrial y las especies reactivas de oxígeno en neuronas corticales de rata. El procedimiento será demostrado por dhi. Hola, soy Denise Jossi.Mediante este procedimiento, se puede medir el potencial de la membrana mitocondrial a nivel de una sola mitocondria y las especies reactivas de oxígeno a nivel de una sola célula. Comencemos. Prepare un stock de 10 milimolar de TMRM disolviendo cinco miligramos de TMRM en un mililitro de óxido de dimetilsulfóxido anhidro y vortexee durante un minuto.Luego, realice alícuotas y almacene las alícuotas a menos 20 grados Celsius. Protéjalo de la luz y utilícelo dentro de un mes. A continuación, prepare un stock de 10 milimolar de H 2D CFDA disolviendo 4,87 miligramos de H 2D CFDA en un mililitro de óxido de dimetilo anhidro.De manera similar, agite en vórtex durante un minuto, luego prepare alícuotas y almacénelas a menos 20 grados Celsius. Protéjalas de la luz y úselas dentro de una semana para cargar primero las neuronas corticales de rata con TMRM. Lave las neuronas cultivadas tres veces con tampón de Tyro.Luego, prepare TMRM de 20 nanomolares diluyendo el stock de TMRM de 10 milimolares 1000 veces en tb. A continuación, agregue dos microlitros del TMRM diluido por cada mililitro de tb. Incube las neuronas con TMRM durante 45 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.Después de 45 minutos, coloque la placa de cultivo sobre la platina del microscopio e inicie la adquisición de imágenes para cargar las neuronas corticales de rata con H2DCFDA, luego lave las neuronas cultivadas tres veces con tb. A continuación, prepare una solución de dos micromoles de H2DCFDA diluyendo 10 veces el stock de H2DCFDA de 10 milimoles en tb. Después, agregue dos microlitros de H2DCFDA diluido por cada mililitro de tb.Luego, incubar las neuronas con H2DCFDA durante 45 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Lavar las neuronas cuatro veces con TB para eliminar el indicador fluorescente en exceso antes de obtener imágenes para realizar imágenes en vivo de neuronas incubadas con TMRM mediante microscopía confocal de barrido con láser, utilizando el programa de series temporales en vivo. Aplicar baja resolución y potencia de láser atenuada para minimizar el tiempo necesario para obtener las imágenes y evitar el fotoblanqueo.A continuación, ajuste el enfoque de las neuronas montadas cargadas con TMRM utilizando luz reflejada. Examine la fluorescencia del TMRM mediante iluminación a cinco 14 nanómetros y detección a cinco 70 nanómetros. Establezca la ganancia de detección de la cámara justo por debajo del nivel de saturación una vez que todos los parámetros, que incluyen resolución, potencia del láser, ganancia de la cámara e intervalo de lapso de tiempo para obtener imágenes, hayan sido configurados.No cambie estas configuraciones entre experimentos. A continuación, cambie el campo. Comience a adquirir imágenes para probar cambios en el estímulo delta PSY M, como la aplicación de un micromolar de FCCP o dos microgramos por mililitro de oligomicina, lo que provocará una despolarización o hiperpolarización significativa del potencial de membrana mitocondrial, respectivamente.Estos cambios se reflejarán en una disminución de la intensidad de fluorescencia de TMRM en comparación con la intensidad de fluorescencia basal en el caso de FCCP, o en un aumento de la intensidad de fluorescencia de TMRM. En el caso de una LIGA myin sin para realizar imágenes en vivo de neuronas incubadas con H 2D CFDA, primero monte el cultivo en la platina de un microscopio y ajuste el enfoque de las células utilizando luz reflejada. Examine la fluorescencia de DCF mediante excitación a 4 88 nanómetros y emisión a cinco 15 nanómetros.A continuación, ajuste la potencia del láser al 5% al 7% para detectar una ganancia y una resolución de 2 56 por 2 56. No cambie estos ajustes entre experimentos. Luego, establezca la frecuencia para obtener imágenes en vivo.Utilizando el programa de series temporales, seleccione un nuevo campo e inicie la adquisición de imágenes para detectar cambios en los niveles de ROS. Trate las células con 100 a 200 micromolar de peróxido de hidrógeno. Esto se reflejará en un aumento de la intensidad de fluorescencia de DCF en comparación con el nivel basal.Utilice la herramienta de región de interés del programa LSM para seleccionar las áreas. Luego, seleccione ROI de las regiones mitocondriales o ROI del cuerpo celular completo en las células de la imagen para medir las intensidades de fluorescencia de TMRM o de ERO, respectivamente.Seleccione regiones adyacentes a las células. Para calcular la intensidad de fluorescencia de fondo, realice varias mediciones y, para calcular la intensidad media de fondo, reste la intensidad media de fluorescencia de fondo de las intensidades medias de fluorescencia de las regiones de interés en cada célula para cada punto temporal utilizando Microsoft Excel. Tras restar la intensidad de fondo, normalice la intensidad de fluorescencia de TMRM o DCF a la fluorescencia basal.Utilizando esta fórmula, use luego el programa SigmaPlot para generar la gráfica que muestre los cambios en la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo. A continuación se muestra un ejemplo de una imagen de fluorescencia de neuronas corticales de rata incubadas con TMRM. La adición de F-C-C-P-A, un desacoplador mitocondrial, conduce a la desolarización mitocondrial y a una pérdida de la intensidad de fluorescencia de TMRM.El nivel de fluorescencia basal de TMRM permanece estable antes de la adición de FCCP. El análisis cuantitativo de los cambios en la fluorescencia de TMRM a lo largo del tiempo muestra una disminución significativa en la fluorescencia de TMRM tras la adición de FCCP. A continuación se muestra un ejemplo de una imagen de fluorescencia de neuronas corticales de rata cargadas con DCF.El nivel basal de fluorescencia de DCF permanece sin cambios durante los primeros 120 segundos antes de la aplicación de peróxido de hidrógeno. La adición de peróxido de hidrógeno provoca un aumento en la intensidad de la fluorescencia de DCF en los cuerpos celulares. Las mediciones de fluorescencia de DCF con lapso de tiempo muestran niveles constantes que han aumentado tras los tratamientos con peróxido de hidrógeno.En este procedimiento, es importante recordar utilizar una potencia láser baja y una velocidad de escaneo rápida para evitar los artefactos provocados por el blanqueo fotográfico y la fototoxicidad. Mucha suerte con su experimento.

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En este estudio, describimos un protocolo paso a paso y enfatizamos los detalles clave para determinar las características morfológicas de las mitocondrias en células vivas, incluida la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Este método se usa comúnmente para examinar la morfología mitocondrial para estudiar diversas afecciones.

Determinación de la morfología mitocondrial en células vivas mediante microscopía confocal

Presentamos un método no invasivo y en tiempo real para monitorizar la salud mitocondrial utilizando la espectroscopía Raman por resonancia (RRS). Utilizamos RRS para cuantificar los estados redox mitocondriales y desarrollamos una métrica para la salud mitocondrial, la Resonancia Raman reduce la relación mitocondrial (3RMR), que muestra una respuesta más rápida a los cambios en la oxigenación que los analitos hemato-gases tradicionales.

Evaluación en tiempo real y no invasiva de la función mitocondrial mediante espectroscopía Raman por resonancia

Aprende a medir el potencial de membrana mitocondrial y especies reactivas de oxígeno en neuronas corticales de rata usando sondas fluorescentes TMRM y H2DCFDA. Este método permite evaluar dinámicas celulares en tiempo real.

Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo (Video) | JoVE Journal

Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

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