Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

El objetivo de este procedimiento es determinar el potencial de membrana mitocondrial y los niveles de especies reactivas de oxígeno en neuronas corticales primarias utilizando las sondas fluorescentes TMRM y H2DCFDA, respectivamente. Esto se logra primero preparando las concentraciones stock y de trabajo de TMRM y H2DCFDA. El segundo paso consiste en incubar las neuronas corticales con TMRM y H2DCFDA a temperatura ambiente durante 45 minutos en tampón Thai roads.

El tercer paso consiste en obtener imágenes de la intensidad de fluorescencia de TMRM y DCF en neuronas corticales vivas utilizando excitación y emisión de 515/517 nanómetros y 488/515 nanómetros, respectivamente. Los cambios en la fluorescencia de TMR se monitorearán en presencia del desacoplador mitocondrial FCCP, mientras que los cambios en la fluorescencia de DCF se monitorearán en presencia de peróxido de hidrógeno. El paso final de este procedimiento es la recopilación, normalización y análisis de los datos.

En última instancia, los resultados se obtienen mediante la elaboración de una gráfica que muestra los niveles relativos de intensidad de fluorescencia de TMRM y DCF antes y después del tratamiento con FCCP y peróxido de hidrógeno, respectivamente. Hola, soy Joanna Koska. Bienvenidos a mi laboratorio en la Universidad Loyola de Chicago.

Hoy les mostraremos cómo medir el potencial de membrana mitocondrial y las especies reactivas de oxígeno en neuronas corticales de rata. El procedimiento será demostrado por dhi. Hola, soy Denise Jossi.

Mediante este procedimiento, se puede medir el potencial de membrana mitocondrial a nivel de mitocondria individual y las especies reactivas de oxígeno a nivel de célula individual. Comencemos. Prepare un stock de 10 milimolar de TMRM disolviendo cinco miligramos de TMRM en un mililitro de dimetilsulfóxido anhidro, y vortexee durante un minuto.

Luego, realice alícuotas y almacene las alícuotas a menos 20 grados Celsius. Protéjalo de la luz y utilícelo dentro de un mes. A continuación, prepare un stock de 10 milimolar de H 2D CFDA disolviendo 4,87 miligramos de H 2D CFDA en un mililitro de sulfóxido de dimetilo anhidro.

De manera similar, agite en vórtex durante un minuto, luego realice alícuotas y almacénelas a menos 20 grados Celsius. Protéjalas de la luz y utilícelas dentro de una semana para cargar primero las neuronas corticales de rata con TMRM. Lave las neuronas en cultivo tres veces con tampón de Tyro.

Luego, prepare TMRM de 20 nanomolares diluyendo el stock de TMRM de 10 milimolares 1000 veces en tb. A continuación, agregue dos microlitros del TMRM diluido por cada mililitro de tb. Incube las neuronas con TMRM durante 45 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.

Después de 45 minutos, coloque la placa de cultivo sobre la platina del microscopio e inicie la adquisición de imágenes para cargar los neuronas corticales de rata con H 2D CFDA, lave las neuronas cultivadas tres veces con tb. A continuación, prepare dos micromoles de H 2D CFDA diluyendo el stock de H 2D CFDA 10 milimolar 10 veces en tb. Luego, agregue dos microlitros de H 2D CFDA diluido por cada mililitro de tb.

Luego, incubar las neuronas con H2DCFDA durante 45 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Después de 45 minutos, lavar las neuronas cuatro veces con TB para eliminar el indicador fluorescente en exceso antes de obtener imágenes para realizar imágenes en vivo de neuronas incubadas con TMRM mediante microscopía confocal de barrido con láser, utilizando el programa de series temporales en vivo. Aplicar baja resolución y potencia de láser atenuada para minimizar el tiempo necesario para obtener las imágenes y evitar el fotoblanqueo.

A continuación, ajuste el enfoque de las neuronas montadas cargadas con TMRM utilizando luz reflejada. Examine la fluorescencia de TMRM mediante iluminación a cinco 14 nanómetros y detección a cinco 70 nanómetros. Establezca la ganancia de detección de la cámara justo por debajo del nivel de saturación una vez que todos los parámetros, que incluyen resolución, potencia del láser, ganancia de la cámara e intervalo de lapso de tiempo para obtener imágenes, hayan sido configurados.

No cambie estas configuraciones entre experimentos. A continuación, cambie el campo. Comience a adquirir imágenes para probar cambios en el estímulo delta PSY M, como la aplicación de un micromolar de FCCP o dos microgramos por mililitro de oligomicina, lo que provocará una despolarización o hiperpolarización significativa del potencial de membrana mitocondrial, respectivamente.

Estos cambios se reflejarán en una disminución de la intensidad de fluorescencia de TMRM en comparación con la intensidad de fluorescencia basal en el caso del FCCP, o en un aumento de la intensidad de fluorescencia de TMRM. En el caso de una LIGA myin sin para realizar imágenes en vivo de neuronas incubadas con H 2D CFDA, primero monte el cultivo en la platina de un microscopio y ajuste el enfoque de las células utilizando luz reflejada. Examine la fluorescencia de DCF mediante excitación a 4 88 nanómetros y emisión a cinco 15 nanómetros.

A continuación, ajuste la potencia del láser al 5% al 7% para detectar una ganancia y una resolución de 2 56 por 2 56. No cambie estos ajustes entre experimentos. Luego, establezca la frecuencia para obtener imágenes en vivo.

Utilizando el programa de series temporales, seleccione un nuevo campo e inicie la adquisición de imágenes para detectar cambios en los niveles de ROS. Trate las células con 100 a 200 micromolares de peróxido de hidrógeno. Esto se reflejará en un aumento de la intensidad de fluorescencia de DCF en comparación con el nivel basal.

Utilice la herramienta de región de interés del programa LSM para seleccionar las áreas. Luego, seleccione ROI de regiones mitocondriales o ROI del cuerpo completo de la célula en las células de la imagen para medir las intensidades de fluorescencia de TMRM o de ERO, respectivamente.

Seleccione regiones adyacentes a las células. Para calcular la intensidad de fluorescencia de fondo, realice varias mediciones y, para calcular la intensidad media de fondo, reste la intensidad media de fluorescencia de fondo de las intensidades medias de fluorescencia de las regiones de interés en cada célula para cada punto temporal utilizando Microsoft Excel. Tras restar la intensidad de fondo, normalice la intensidad de fluorescencia de TMRM o DCF a la fluorescencia basal.

Utilizando esta fórmula, use luego el programa Sigma Plot para generar la gráfica que muestra los cambios en la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo. A continuación se muestra un ejemplo de una imagen de fluorescencia de neuronas corticales de rata incubadas con TMRM. La adición de F-C-C-P-A, un desacoplador mitocondrial, conduce a la desolarización mitocondrial y a una pérdida de la intensidad de fluorescencia de TMRM.

El nivel basal de fluorescencia de TMRM permanece estable antes de la adición de FCCP. El análisis cuantitativo de los cambios en la fluorescencia de TMRM a lo largo del tiempo muestra una disminución significativa en la fluorescencia de TMRM tras la adición de FCCP. A continuación se muestra un ejemplo de una imagen de fluorescencia de neuronas corticales de rata cargadas con DCF.

El nivel basal de fluorescencia de DCF permanece sin cambios durante los primeros 120 segundos antes de la aplicación de peróxido de hidrógeno. La adición de peróxido de hidrógeno provoca un aumento en la intensidad de la fluorescencia de DCF en los cuerpos celulares. Las mediciones de fluorescencia de DCF con lapso de tiempo muestran niveles constantes que han aumentado tras los tratamientos con peróxido de hidrógeno.

En este procedimiento, es importante recordar utilizar una potencia láser baja y una velocidad de escaneo rápida para evitar los artefactos provocados por el blanqueo fotográfico y la fototoxicidad. Mucha suerte con su experimento.