Name: Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende a cultivar células epiteliales pigmentadas del iris de tritones para estudiar la regeneración del cristalino in vitro. Este método permite analizar histológicamente la formación de lentes y explorar factores genéticos en biología regenerativa.

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Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH Ey10540 a PAT.

1. Iris cultivo celular <ol><li> Recoger los globos oculares de 7 tritones (anestesiados en el 0,1% el 3-aminobenzoato de ácido metano sulfónico preparado en PBS) y el lugar en el calcio, magnesio libre Hanks solución (CMF). </li><li> Cambie los guantes y trabajar en la campana de cultivo de tejidos. </li><li> Esterilizar globos oculares en Lugol-EtOH durante 3 segundos. </li><li> Lavar dos veces en el CMF. </li><li> La transferencia de los ojos de Hanks y comenzar la disección. </li><li> Diseccionar iris-corneal complejo y eliminar la retina neural. </li><li> La transferencia de los complejos en un nuevo plato de Hanks. </li><li> # 15 complejos utilizando bisturí, separada en dos mitades dorsal y ventral. </li><li> Extraer los fragmentos del iris (ventral primero) y colóquelo en un recipiente que contenga 1 ml L-15. </li><li> Añadir un 15% (150 ul) de volumen de dispasa (7,5 unidades / ml de concentración). </li><li> Se incuba a 27 ° C durante 2 horas (plato envolver con parafilm). </li><li> Aislar las células del estroma de IPE (solución Colocar tripsina a 27 ° C). </li><li> Recoger las células IPE en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente (temperatura ambiente) durante 2 minutos, retire el sobrenadante. </li><li> Lavar con 1 ml Hanks y centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos, retire el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de solución de tripsina, se incuba durante 2 horas a 27 ° C. </li><li> Centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos, retire la tripsina. </li><li> Añadir 1 ml L-15 para lavar, centrifugar a 1000 rpm durante 2 minutos. </li><li> Añadir 800 ul L-15, pipeta lentamente hacia arriba y hacia abajo ~ 10 veces (más de 12 veces se reduce la adherencia). </li><li> Placa de las células IPE en un plato de colágeno 24 pozos cubierto y se incuba a 27 ° C durante 2 semanas (por lo general, cuatro dorsal y ventral 4 pozos se obtienen a partir de 7 tritones). </li><li> En esta etapa las células son adecuados para la transfección de genes o el tratamiento con los factores para determinar su papel en la inducción o interferir con la regeneración de la lente. </li></ol> 2. La agregación de células Iris <ol><li> A las placas que contienen las células del iris añadir 20μl de solución dispasa a 400 l medio, revuelva suavemente. </li><li> Incubar las placas a 27 ° C durante la noche. </li><li> Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células </li><li> Células de lugar en el tubo Eppendorf y girar durante 2 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Quitar y lavar medio mediante la adición de 1 ml L-15 completa, spin 2 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente, quite medio. </li><li> Use 2000-7000 células por agregada. Añadir 200 ul L-15 por el agregado en cada tubo. </li><li> Las células se dividen (200 l) en los nuevos tubos eppendorf. </li><li> Giran a 1000 rpm durante 2 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubar durante 48 horas a 27 ° C. </li></ol> 3. La implantación de células Aggregrated <ol><li> Haga un corte en la córnea del ojo de tritón y quitar la lente. </li><li> Después de extracción del cristalino, coloque el agregado de células IPE justo por debajo del tejido de la córnea en la parte ventral del ojo. </li><li> Los tritones se mantienen durante un mes para dejar que la regeneración del lente. </li></ol> 4. Incorporación de los ojos Newt <ol><li> Quitar los ojos de tritón implantado con el agregado y lo coloca en tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Fijar en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante al menos 4 horas o toda la noche. </li><li> Se lavan con PBS, 4 ° C durante 30 minutos. </li><li> Tratar con 0,85% de solución salina: 4 ° C, 30 minutos. </li><li> De lavado en solución salina / etanol (1:1): RT durante 15 minutos. </li><li> De lavado en etanol al 70%: RT, de 15 minutos. Repetir una vez. </li><li> Lave en el 85% de etanol y 95% de etanol a temperatura ambiente, 30 minutos cada uno </li><li> De lavado en etanol al 100%: RT, de 30 minutos. Repetir una vez. </li><li> Almacenar a 4 ° C o continuar. </li><li> Lave en xileno al 100%: RT, de 30 minutos. Repetir una vez. </li><li> Tratar con xileno / parafina (1:1): 60 ° C, 45 minutos. </li><li> Tratar con el 100% de parafina: 60 ° C, 20 minutos. Repítelo dos veces más. </li><li> Integrar al incorporar los moldes. </li></ol> 5. Seccionamiento <ol><li> Prepare 15 secciones micras de los ojos incrustados utilizando un microtomo. </li><li> Coloque las secciones de los ojos en un portaobjetos recubiertos de gelatina y se deja en una lámina caliente. </li></ol> 6. Tinción <ol><li> Coloque los portaobjetos en xileno durante 10 minutos. Repetir una vez más. </li><li> De hidratos en: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% de etanol durante 1 minuto cada uno </li><li> Enjuague con agua DI por un minuto. </li><li> Se lavan con PBS durante 15 minutos. </li><li> Lave en PBST (0,2% Triton X-100 en PBS) durante 15 minutos. </li><li> Se lavan con PBS durante 15 minutos. </li><li> Lugar en solución de bloqueo (10% anticuerpo de cabra secundaria) durante una hora. </li><li> Lugar en el anticuerpo primario durante la noche. </li><li> Lavar el anticuerpo primario en PBS durante 15 minutos. </li><li> Lave en PBST durante 15 minutos. </li><li> Se lavan con PBS durante 15 minutos. </li><li> Lugar en el anticuerpo secundario durante 2 horas en la oscuridad (dilución 1:100 en PBS). </li><li> Se lavan con PBS, PBST, y PBS durante 15 minutos cada uno y luego montar. </li><li> Los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Este procedimiento de cultivo tritón ires que las células se ha utilizado para estudiar el potencial de regeneración de la parte dorsal y ventral de las células IPE. Por otra parte, también es posible estudiar los genes específicos que contribuyen a la regeneración del mecanismo de la lente en el ojo de tritón. Cuando las células han sido cultivadas durante dos semanas (Figura 1) pueden ser transfectadas por los genes para examinar su función en la regeneración de la lente. De particular interés son los genes que pueden inducir el iris ventral. Dado que el ventral las células del iris no puede transdiferenciarse a la lente (Figura 2) la función de inducción de un gen candidato puede ser estudiado. En el pasado, con esta técnica se ha demostrado que, cuando seis-3 se expresó sobre la presencia de la inducción de la lente ácido retinoico se observó desde el ventral iris 6. En la figura 3 se puede observar que el ventral agregado iris dio lugar a una lente completamente desarrollado y diferenciado (cabeza de flecha), no diferente de la lente de host de la dorsal del iris (flecha). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. a) dorsal iris células epiteliales pigmentadas cultivados in vitro durante un periodo de 2 semanas. b) ventral iris células epiteliales pigmentadas cultivados in vitro durante un periodo de 2 semanas. Tenga en cuenta que persiste la pigmentación de esta etapa en las células del iris dorsal y ventral. <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La regeneración de la capacidad de los cultivos de células de IPE. a) la inducción de la lente de agregados celulares dorsal IPE (cabeza de flecha). Anfitrión de la lente de inducción dorsal iris (flecha), di: dorsal iris, vi: ventral iris, le: epitelio del cristalino, Si: las fibras del cristalino. b) La ausencia de inducción de la lente de agregados de células IPE ventral (flecha). Anfitrión de la lente de inducción dorsal iris (flecha). <img src="/files/ftp_upload/2713/2713fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La inducción de la lente de agregado ventral transfectadas con seis-3 y se trata con ácido retinoico. Anfitrión de la lente de inducción dorsal iris (flecha). Lente de la inducción de agregado ventral (flecha).

<ol><li>Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration in vertebrates.</a> Dev Biol. 221, 273-284 (2000).</li>
<li>Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newt%27s+eye+view+of+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A newt's eye view of lens regeneration.</a> Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).</li>
<li>Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+regeneration+at+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Eye regeneration at the molecular age.</a> Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).</li>
<li>Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+between+dorsal+and+ventral+iris+in+lens+producing+potency+in+normal+lens+regeneration+is+maintained+after+dissociation+and+reaggregation+of+cells+from+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).</li>
<li>Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+system+for+functional+gene+analysis+in+adult+amphibian+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration.</a> Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).</li>
<li>Grogg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+inhibition-driven+regulation+of+six-3+underlies+induction+of+newt+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration.</a> Nature. 438, 858-862 (2005).</li>
<li>Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+in+Newt+Lens+Regeneration%3A+Specific+Control+of+Proliferation+and+Evidence+for+miRNA+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking.</a> PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).</li>
<li>Madhavan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax-6+in+lens+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The role of Pax-6 in lens regeneration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).</li>
<li>Maki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-type+linker+histone+B4+is+required+for+transdifferentiation+of+somatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo.</a> FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).</li>
</ol>

Este protocolo se ha establecido un sistema in vitro para estudiar los mecanismos de regeneración en la lente de tritones. Dado que los agregados (ya sea dorsal o ventral siguen fielmente a sus comportamiento in vivo durante la regeneración de esta técnica puede aliviar el enorme esfuerzo necesario para la transgénesis en tritones y puede ser usado para ganancia de función, así como la pérdida de 7,8,9 experimentos de la función. También , los agregados o el iris en su conjunto se puede tratar fácilmente con factores de crecimiento y examinar sus efectos como se describe en este protocolo. Por ejemplo, el papel de la vía BMP ha sido estudiado con esta técnica 6.

<table><tbody><tr><td>Solución de Lugol&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6146</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Ácido metanosulfónico de etil 3-aminobenzoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 1:250</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>L-15 (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4386</td><td></td></tr><tr><td>DNasa 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>100x, 15160</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone (solución de anfotericina B)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos recubierta con colágeno</td><td>BD Biosciences</td><td>354408</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el estudio de regeneración del objetivo de newt

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamandras y tritones como ajolote poseen la capacidad de regenerar muchas de sus partes del cuerpo perdido, como las extremidades, la cola con la médula espinal, ojos, cerebro, corazón, la mandíbula 1. En concreto, los tritones son únicos por su capacidad de regeneración de la lente. Tras la eliminación de lentes, las células de la IPE dorsal iris transdiferenciarse a las células del cristalino y, finalmente, formar un nuevo objetivo dentro de un mes 2,3. Esta propiedad de la regeneración no es exhibida por la ventral las células del iris. El potencial de regeneración de las células del iris puede ser estudiado por lo que los trasplantes de la in vitro IPE células cultivadas. Para el cultivo, las células del iris dorsal y ventral se aisló por primera vez a los ojos y cultivados por separado durante un periodo de 2 semanas (Figura 1). Estas células cultivadas se reaggregated y se implanta de nuevo al ojo de tritón. Estudios anteriores han demostrado que el reaggregate dorsal mantiene su capacidad de formación de la lente, mientras que el agregado ventral no forma una lente, recapitulando, por lo tanto el proceso en vivo (Figura 2) 4,5. Este sistema de determinación del potencial de regeneración de las células del iris dorsal y ventral es muy útil para estudiar el papel de los genes y las proteínas implicadas en la regeneración de la lente.

En Tritón, la lente siempre se regenera a partir de la dorsal del iris por la transdiferenciación de las células epiteliales pigmentadas de iris (IPE). Aquí se describe un procedimiento para cultivar células tritón dorsal y ventral IPE y su implantación en el ojo de tritón. Las células implantadas se estudian por el corte de tejidos e inmunohistoquímica.

Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt

Las salamandras, como el tritón y el ajolote, poseen la capacidad de regenerar muchas de sus partes corporales perdidas, tales como las extremidades, la cola con la médula espinal, el ojo, el cerebro...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células del epitelio pigmentado del iris para estudiar la regeneración del cristalino en tritón. Esto se logra primero anestesiando al tritón en una solución anestésica y extrayendo los ojos.El segundo paso del procedimiento consiste en aislar las células epiteliales pigmentadas del iris del tejido ocular eliminando primero el tejido retiniano, seguido del corte de fragmentos de iris corneal en mitades dorsal y ventral. Las células del iris se separan luego del estroma y se cultivan in vitro durante dos semanas. Después de dos semanas de Turing, las células EPI se agregan y luego se implantan en una nueva cría que ha sido lin optimiz.Después de un mes de cicatrización, la histología revela el potencial de regeneración del cristalino de las células del epitelio pigmentado del iris dorsal y ventral. La demostración visual de este método es fundamental en los pasos de cultivo celular e implantación, difíciles de aprender porque requieren buenas habilidades en microdisección y cirugías. Comience por anestesiar al menos siete ratones desnudos con etil 3-aminobenzoato metanosulfonato al 0,1 %; quirúrgicamente, retire sus ojos utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas, cortando el párpado junto con la conjuntiva. Luego, corte el nervio óptico.Ahora, traslade rápidamente los ojos diseccionados a una campana y esterilícelos en etanol de Lugo durante tres segundos. Luego lave los ojos dos veces con solución de Hank sin calcio ni magnesio. Trasládelos a Hank fresco y continúe con la disección.Con un escalpelo, haga una incisión en el ojo. Luego use tijeras para cortar alrededor del margen corneal. Retire el cristalino y corte el tejido retiniano restante junto con la esclerótica.Transfiera los complejos iridocorneales a un recipiente con Hanks fresco utilizando un escalpelo número 15. Separe los complejos en sus mitades dorsal y ventral. Las irises dorsal y ventral se identifican por la presencia de manchas negras en la esclerótica del lado dorsal y por un corte en forma de V en el iris ventral.Separar el iris ventral y el iris dorsal. Recoger los fragmentos de iris en una placa de 35 milímetros que contenga un mililitro de solución L 15. Mantener las mitades dorsal y ventral en placas separadas.Ahora añada 150 microlitros de solución dispa a las placas y incúbelas durante dos horas a 27 grados Celsius. Para recolectar células EPI del estroma. Con ayuda de pinzas, desprenda suavemente las células EPI de todos los fragmentos de tejido recolectados.A continuación, transfiera las células IPE a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 1000 RP M durante dos minutos a temperatura ambiente; deseche el sobrenadante. Reuspenda el precipitado en un mililitro de solución de Hanks y repita la centrifugación para separar las células. Deseche la solución de Hanks y re suspenda el precipitado.En un mililitro de una solución de tripsina uno a 250, incubar durante dos horas a 27 grados Celsius para lavar las células, centrifugar y eliminar la tripsina. Añadir un mililitro de solución L 15 y centrifugar nuevamente, repetir el lavado una vez más y sustituir con 800 microlitros de solución L 15 fresca, y pipetear suavemente las células hasta disolverlas. Ahora, sembrar las células en placas de 24 pocillos recubiertas con colágeno.El rendimiento habitual de siete Ns es de cuatro pocillos de células dorsales y cuatro pocillos de células ventrales. Incubar el cultivo durante dos semanas a 27 grados Celsius tras dos semanas. Aquí se muestra que el IPE puede ser transfectado con genes para examinar su función en la regeneración del cristalino.Este cultivo de dos semanas de células IPE ventrales exhibe la misma morfología que las células dorsales. Obsérvese que la pigmentación persiste hasta esta etapa tanto en las células del iris dorsal como en las ventrales. Antes de implantar las células IPE, deben agregarse añadiendo 20 microlitros de dyse en 400 microlitros de medio de cultivo fresco a las células, girar suavemente la placa y dejar las células durante la noche en un incubador a 27 grados Celsius.Al día siguiente, utilice pipeteo suave para despegar las células y luego transfiéralas a tubos de 1,5 mililitros; ahora lave las células centrifugando los tubos y reemplazando el sobrenadante con un mililitro de L-15. Repita este paso dos veces. Utilice 10 microlitros de la suspensión celular para calcular el recuento celular mediante métodos estándar.Una vez calculado, prepare de 3000 a 5000 células en 200 microlitros de L-15 por agregado. Ahora centrifugue las células e incúbelas durante 48 horas. A 27 grados Celsius, las células ya pueden implantarse en un animal receptor.Comience por anestesiar un adulto nuevo en la solución anestésica hasta que deje de moverse. Ahora use una hoja de bisturí para hacer una incisión en la córnea del ojo. Luego, utilizando pinzas, retire el cristalino.Después de extraer el cristalino, coloque el agregado de células del IPE justo debajo del tejido corneal en el lado ventral del ojo. Ahora devuelva la salamandra a un recipiente separado y permita que sane. Durante este tiempo, manipule la salamandra con cuidado para evitar dañar el tejido en proceso de curación.Las células trasplantadas requieren un mes para regenerarse en un nuevo cristalino. Después de transcurrido un mes, retire los nuevos ojos implantados con las células agregadas y fije el tejido. Mediante un protocolo estándar de deshidratación, el material fijado puede incluirse en moldes de inclusión adecuados para cortar secciones de 15 micrómetros, que luego se cortan y tiñen apropiadamente.Después de la implantación del agregado en el ojo lento nuevo, el agregado proveniente de las células del EPI dorsal induce la formación de un nuevo cristalino. También se observa la inducción del cristalino del hospedador a partir del iris dorsal en el ojo con el implante ventral. No se observa inducción del cristalino a partir del agregado preparado a partir de las células del EPI ventral cuando el gen six three está sobreexpresado; sin embargo, en presencia de ácido retinoico, se observa inducción del cristalino a partir del agregado ventral.Además, se observa la inducción del cristalino huésped a partir del iris dorsal del ojo tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración del cristalino exploraran el papel de diferentes genes en un nuevo contexto.

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