Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt
22 de junio de 2011
En Tritón, la lente siempre se regenera a partir de la dorsal del iris por la transdiferenciación de las células epiteliales pigmentadas de iris (IPE). Aquí se describe un procedimiento para cultivar células tritón dorsal y ventral IPE y su implantación en el ojo de tritón. Las células implantadas se estudian por el corte de tejidos e inmunohistoquímica.
El objetivo general de este procedimiento es cultivar células del epitelio pigmentado del iris para estudiar la regeneración del cristalino en tritón. Esto se logra primero anestesiando al tritón en una solución anestésica y extrayendo los ojos.
El segundo paso del procedimiento consiste en aislar las células epiteliales pigmentadas del iris del tejido ocular eliminando primero el tejido retiniano, seguido del corte de fragmentos de iris corneal en mitades dorsal y ventral. Las células del iris se separan luego del estroma y se cultivan in vitro durante dos semanas. Después de dos semanas de Turing, las células EPI se agregan y luego se implantan en una nueva cría que ha sido lin optimiz.
Después de un mes de cicatrización, la histología revela el potencial de regeneración del cristalino de las células del epitelio pigmentado del iris dorsal y ventral. La demostración visual de este método es fundamental en los pasos de cultivo celular e implantación, difíciles de aprender porque requieren buenas habilidades en microdisección y cirugías. Comience por anestesiar al menos siete ratones desnudos con etil 3-aminobenzoato metanosulfonato al 0,1 %; quirúrgicamente, retire sus ojos utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas, cortando el párpado junto con la conjuntiva. Luego, corte el nervio óptico.
Ahora, traslade rápidamente los ojos diseccionados a una campana y esterilícelos en etanol de Lugo durante tres segundos. Luego lave los ojos dos veces con solución de Hank sin calcio ni magnesio. Trasládelos a Hank fresco y continúe con la disección.
Con un escalpelo, haga una incisión en el ojo. Luego use tijeras para cortar alrededor del margen corneal. Retire el cristalino y corte el tejido retiniano restante junto con la esclerótica.
Transfiera los complejos iridocorneales a un recipiente con Hanks fresco utilizando un escalpelo número 15. Separe los complejos en sus mitades dorsal y ventral. Las irises dorsal y ventral se identifican por la presencia de manchas negras en la esclerótica del lado dorsal y por un corte en forma de V en el iris ventral.
Separar el iris ventral y el iris dorsal. Recoger los fragmentos de iris en una placa de 35 milímetros que contenga un mililitro de solución L 15. Mantener las mitades dorsal y ventral en placas separadas.
Ahora añada 150 microlitros de solución dispa a las placas y incúbelas durante dos horas a 27 grados Celsius. Para recolectar células EPI del estroma. Con ayuda de pinzas, desprenda suavemente las células EPI de todos los fragmentos de tejido recolectados.
A continuación, transfiera las células IPE a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue a 1000 RP M durante dos minutos a temperatura ambiente; deseche el sobrenadante. Reuspenda el precipitado en un mililitro de solución de Hanks y repita la centrifugación para separar las células. Deseche la solución de Hanks y re suspenda el precipitado.
En un mililitro de una solución de tripsina uno a 250, incubar durante dos horas a 27 grados Celsius para lavar las células, centrifugar y eliminar la tripsina. Añadir un mililitro de solución L 15 y centrifugar nuevamente, repetir el lavado una vez más y sustituir con 800 microlitros de solución L 15 fresca, y pipetear suavemente las células hasta disolverlas. Ahora, sembrar las células en placas de 24 pocillos recubiertas con colágeno.
El rendimiento habitual de siete Ns es de cuatro pocillos de células dorsales y cuatro pocillos de células ventrales. Incubar el cultivo durante dos semanas a 27 grados Celsius tras dos semanas. Aquí se muestra que el IPE puede ser transfectado con genes para examinar su función en la regeneración del cristalino.
Este cultivo de dos semanas de células IPE ventrales exhibe la misma morfología que las células dorsales. Obsérvese que la pigmentación persiste hasta esta etapa tanto en las células del iris dorsal como en las ventrales. Antes de implantar las células IPE, deben agregarse añadiendo 20 microlitros de dyse en 400 microlitros de medio de cultivo fresco a las células, girar suavemente la placa y dejar las células durante la noche en un incubador a 27 grados Celsius.
Al día siguiente, utilice pipeteo suave para despegar las células y luego transfiéralas a tubos de 1,5 mililitros; ahora lave las células centrifugando los tubos y reemplazando el sobrenadante con un mililitro de L-15. Repita este paso dos veces. Utilice 10 microlitros de la suspensión celular para calcular el recuento celular mediante métodos estándar.
Una vez calculado, prepare de 3000 a 5000 células en 200 microlitros de L-15 por agregado. Ahora centrifugue las células e incúbelas durante 48 horas. A 27 grados Celsius, las células ya pueden implantarse en un animal receptor.
Comience por anestesiar un adulto nuevo en la solución anestésica hasta que deje de moverse. Ahora use una hoja de bisturí para hacer una incisión en la córnea del ojo. Luego, utilizando pinzas, retire el cristalino.
Después de extraer el cristalino, coloque el agregado de células del IPE justo debajo del tejido corneal en el lado ventral del ojo. Ahora devuelva la salamandra a un recipiente separado y permita que sane. Durante este tiempo, manipule la salamandra con cuidado para evitar dañar el tejido en proceso de curación.
Las células trasplantadas requieren un mes para regenerarse en un nuevo cristalino. Después de transcurrido un mes, retire los nuevos ojos implantados con las células agregadas y fije el tejido. Mediante un protocolo estándar de deshidratación, el material fijado puede incluirse en moldes de inclusión adecuados para cortar secciones de 15 micrómetros, que luego se cortan y tiñen apropiadamente.
Después de la implantación del agregado en el ojo lento nuevo, el agregado proveniente de las células del EPI dorsal induce la formación de un nuevo cristalino. También se observa la inducción del cristalino del hospedador a partir del iris dorsal en el ojo con el implante ventral. No se observa inducción del cristalino a partir del agregado preparado a partir de las células del EPI ventral cuando el gen six three está sobreexpresado; sin embargo, en presencia de ácido retinoico, se observa inducción del cristalino a partir del agregado ventral.
Además, se observa la inducción del cristalino huésped a partir del iris dorsal del ojo tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración del cristalino exploraran el papel de diferentes genes en un nuevo contexto.
Descripción general
Este estudio describe un método para cultivar células del epitelio pigmentado del iris (IPE) de tritones para investigar la regeneración del cristalino. El procedimiento incluye el aislamiento e implantación de estas células en el ojo del tritón, seguido de un análisis histológico para evaluar la formación del cristalino.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Regenerativa
- Técnicas de Cultivo Celular
Antecedentes
- Las salamandras poseen la capacidad de regenerar cristalinos a partir de células del epitelio iridiano dorsal.
- Las células epiteliales pigmentadas de la iris (IPE) desempeñan un papel crucial en este proceso de regeneración.
- Comprender los mecanismos de la regeneración del cristalino puede aportar conocimientos importantes para la medicina regenerativa.
- Estudios previos han demostrado el potencial de las IPE en la formación del cristalino.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para cultivar IPE dorsal y ventral de tritones.
- Investigar las capacidades de regeneración del cristalino de estas células cultivadas.
- Proporcionar una demostración visual de las técnicas de cultivo celular e implantación.
Métodos Utilizados
- Anestesia y extracción quirúrgica de los ojos de tritón.
- Aislamiento de células del epitelio pigmentario del iris (IPE) a partir de fragmentos del iris dorsal y ventral.
- Cultivo in vitro de células IPE durante dos semanas.
- Implantación de células IPE agregadas en los ojos receptores de tritón.
Resultados principales
- El análisis histológico reveló una regeneración exitosa del cristalino a partir de implantes de EPI dorsal.
- No se observó inducción del cristalino a partir de células de EPI ventral a menos que se sobreexpresaran genes específicos.
- El estudio demostró la importancia de las EPI dorsales en la formación del cristalino.
- Las células de EPI transfectadas mantuvieron su morfología y pigmentación durante el cultivo.
Conclusiones
- El método establecido es efectivo para estudiar la regeneración del cristalino en las salamandras.
- Investigaciones futuras pueden explorar los factores genéticos que influyen en la regeneración del cristalino.
- Esta técnica podría ayudar a comprender los procesos regenerativos en otras especies.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite reducir los riesgos mecanicistas en las vías de regeneración del cristalino al proporcionar un sistema reproducible in vitro para investigar la función de las células epiteliales pigmentadas del iris dorsal frente al ventral. Apoya la validación de objetivos en biología regenerativa mediante el aislamiento de variables que rigen la capacidad de transdiferenciación. El sistema ofrece valor predictivo para priorizar objetivos genéticos y moleculares en las etapas preclínicas de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de la capacidad formadora de lente de células IPE dorsales y ventrales cultivadas.
- Valor operativo: Permite la desaceleración biológica mediante ensayos de reagregación e implantación que recapitulan el potencial regenerativo in vivo.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar qué manipulaciones genéticas restauran la función regenerativa en agregados de células IPE ventrales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayos: Produce agregados de IPE estandarizados adecuados para cribados de compuestos o genéticos posteriores en un sistema relevante para la enfermedad.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición de la inducción del cristalino como lectura funcional tras la implantación y la cicatrización.
- Escalabilidad: Permite protocolos de placas multipocillo y agregación para pruebas paralelas de condiciones experimentales.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela un proceso regenerativo con polaridad dorsal-ventral clara, lo que proporciona información sobre las señales posicionales en la reparación de tejidos.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos del cultivo in vitro con resultados in vivo mediante la validación histológica de la formación del cristalino.
- Reducción del riesgo mecanicista: Clarifica las contribuciones específicas de los genes en la regeneración, como el papel de six3 y del ácido retinoico en la reprogramación del epitelio pigmentario del iris ventral.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir la validación basada en hipótesis de los objetivos de regeneración antes de comprometerse con la optimización del fármaco líder o con estudios de eficacia preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al aislamiento de células IPE para probar el potencial de transdiferenciación en condiciones controladas.
- Selección: Proporciona agregados cuantitativos y reproducibles para evaluar modificadores genéticos o farmacológicos de la regeneración del cristalino.
- Análisis: Genera puntos finales histológicos que permiten comparar la capacidad regenerativa entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta fenotipos in vitro con la restauración de tejidos in vivo, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar mecanismos de regeneración frente a múltiples perturbaciones genéticas o ambientales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona información mecanicista sobre la plasticidad celular del iris y reduce la ambigüedad en la validación de dianas para la regeneración.
- Valor operativo: Ofrece procedimientos estandarizados y escalables de cultivo celular e implantación, con plazos definidos de dos semanas de cultivo y un mes de cicatrización.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al confirmar si las intervenciones moleculares restauran la función regenerativa en tipos celulares no permisivos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas según su capacidad para inducir la formación del cristalino en agregados de EPI ventral.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, disección de tejidos y manipulación estéril de células para el aislamiento y agregación del iris.
- Depende de placas recubiertas con colágeno, medio L15, tripsina y reactivos de disociación para obtener un rendimiento constante de células del epitelio del iris (IPE).
- Necesita protocolos estandarizados de agregación que utilicen colorante e incubación controlada para garantizar la formación reproducible de agregados.
- Exige experiencia en procesamiento histológico y microtomía para evaluar los resultados de la regeneración del cristalino un mes después del implante.
- Está limitado por la disponibilidad de especímenes de tritón y por la dificultad técnica de separar el iris dorsal del ventral basándose en los marcadores anatómicos.
