Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

El objetivo de este experimento es generar tejidos tridimensionales similares a esteroides. Esto se logra primero recolectando células cultivadas y luego generando una suspensión de células individuales. A continuación, se depositan gotas de la suspensión celular en la parte inferior de la tapa invertida de un recipiente de cultivo de tejidos.

Luego, la tapa se invierte sobre la cámara de hidratación. El paso final consiste en incubar las gotas colgantes durante 24 a 48 horas para permitir la formación de agregados. Estos luego pueden transferirse a un baño de agua con agitación e incubar durante hasta cinco días más.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran diferencias en la cohesión de agregados o en la organización celular mediante ensayos de compactación, análisis de la simetría de la superficie del tejido o microscopía de epifluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el cultivo convencional de tejidos en 2D, por ejemplo, es que las células cultivadas en 3D imitan más de cerca las interacciones celulares que experimentan las células en un entorno tisular. Demostraré este método para mostrarles que es tan sencillo que hasta un investigador principal puede realizarlo.

Para comenzar este experimento, recolecte las células adherentes al 90 % de confluencia. Primero, aspire el medio de cultivo y enjuague la capa celular dos veces con PBS. Luego, aspire el PBS y agregue dos mililitros de tripsina al 0,05 % en solución de EDTA sobre la monocapa.

Coloque la placa en el incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius e incube hasta que las células se desprendan. A continuación, retire la placa del incubador y detenga la ization. Añadiendo dos mililitros de medio completo.

Utilice una pipeta de cinco mililitros para triturar la mezcla hasta que las células estén completamente en suspensión. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Pipete 40 microlitros de una solución de ADN de 10 miligramos por mililitro en la suspensión celular e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos tras la incubación.

Vortex la suspensión celular brevemente y luego centrifugue a 200 veces la gravedad durante cinco minutos. Una vez finalizada la centrifugación, aspire el sobrenadante S y deséchelo, luego resuspenda el botón en un mililitro de medio completo para lavar. Repita la centrifugación y resuspenda el botón en un mililitro de medio completo.

A continuación, realice un recuento celular utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro. Ajuste la suspensión celular con medio a una concentración final de 2,5 × 10⁶ células por mililitro. Luego, proceda a la formación de gotas colgantes.

Prepare una cámara de hidratación retirando la tapa de una placa de cultivo celular de 60 milímetros y pipeteando cinco mililitros de PBS en el fondo de la placa. Invierta la tapa de la placa y pipetee hasta 2010 microlitros de gotas de suspensión celular en la parte inferior de la tapa. Asegúrese de colocar las gotas lo suficientemente separadas como para que no se toquen.

Coloque suavemente la tapa que contiene los cultivos por goteo de nuevo sobre la base del recipiente que contiene PBS. Coloque la placa de cultivo en una incubadora de cultivos de tejidos, a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono y 95 % de humedad, e incube durante la noche.

Monitoree las gotas diariamente y continúe la incubación hasta que se formen láminas celulares o agregados. Una vez que se hayan formado láminas celulares o agregados, transfiéralos a frascos de vidrio redondos para agitación que contengan tres mililitros de medio completo. Incube los frascos que contienen las láminas celulares o agregados en un baño de agitación con agua.

Mantenido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas hasta que la formación de esteroides pueda visualizarse bajo un microscopio estereoscópico. Una vez que se han formado los esteroides, el efecto de las manipulaciones experimentales sobre la formación de esteroides puede cuantificarse según el procedimiento descrito en el protocolo escrito. Además, ahora puede visualizarse la intercalación en la membrana de cualquier colorante fluorescente previamente incluido mediante microscopía de fluorescencia.

Esta imagen de microscopía de campo claro muestra la agregación de células de cáncer de próstata de rata MLL tras 18 horas de incubación mediante el método de gota colgante. Esta imagen muestra un segundo agregado de células MLL formado tras 18 horas de cultivo utilizando el método de gota colgante. Estas células se cultivaron en presencia de 25 micromolar del inhibidor de MEK PD 9 8 0 5 9, lo que resultó en un agregado celular considerablemente más compacto.

Aquí se muestra la diferencia entre el cultivo en gota colgante de MLL tratado con inhibidor de MEK, el tamaño del agregado y el tamaño del agregado control no tratado. El asterisco representa una diferencia estadísticamente significativa con un valor de P menor a 0,0001. Según se determinó mediante la prueba t de Student entre agregados no tratados y tratados con inhibidor de MEK, esto sugiere que el tratamiento con inhibidor de MEK da como resultado agregados significativamente más pequeños y más compactos.

Esta imagen fue capturada utilizando un microscopio estéreo Nikon Smz 800 e ilustra un esteroide formado mediante la incubación de células hepáticas de embrión de pollo en cultivo por gota colgante durante 18 horas. Luego, en un baño de agua agitado a 37 grados Celsius durante 48 horas. Esta imagen de microscopía confocal demuestra el comportamiento de separación que ocurre cuando ciertas poblaciones celulares se cultivan conjuntamente mediante el método de gota colgante; antes de proceder al cultivo por gota colgante, las células hepáticas de embrión de pollo fueron marcadas con el colorante interno de membrana pkh dos y embrión de pollo.

Las células cardíacas fueron teñidas con PKH 26. Las suspensiones celulares se mezclaron luego mediante la técnica de gota colgante. Se realizó el cultivo durante 18 horas, seguido de 48 horas de incubación en baño de agua agitado a 37 grados Celsius.

Puede observarse en la sección óptica que las células cardíacas coloreadas en amarillo están envueltas por células hepáticas. Aquí pseudocoloreadas en azul, dos nardi y clones de células L transfectadas que expresan NCA en sus superficies. En una proporción de 2,4 a 1, se tiñeron con los colorantes fluorescentes de membrana PKH2 y PKH26 mezclados en proporciones iguales y se cultivaron en gotas colgantes como antes.

En este ejemplo, las células que expresan cadian de alto nivel, coloreadas artificialmente de verde, están envueltas por aquellas que expresan niveles más bajos de en cadian, coloreadas artificialmente de rojo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos o menos si se lleva a cabo correctamente.