Name: Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende a generar esferoides 3D mediante cultivo en gota colgante para estudiar interacciones celulares. Este método rápido permite evaluar diferencias en la cohesión y clasificación celular en biología celular.

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El autor desea agradecer al Dr. Jia Dongxuan de asistencia técnica. Algunas de las imágenes que aparecen en este artículo fueron en colaboración con el Dr. Malcolm S. Steinberg, del Departamento de Biología Molecular, Universidad de Princeton. El autor también desea agradecer al Departamento de Defensa, Programa de Investigación de Cáncer de Próstata (subvenciones 030.482 PC y PC-991552) y el de NCI / NIH (subvención R01CA118755) su generoso apoyo.

1. Preparación de una suspensión de células individuales <ol><li> Adherente culturas de células deben ser cultivadas a 90% de confluencia, las monocapas con lo cual se deben enjuagar dos veces con PBS. Después de drenar bien, añadir 2 ml (para placas de 100 mm) de la tripsina-1 0.05% mM EDTA y se incuba a 37 ° C hasta que las células separar. Dejar de tripsinización mediante la adición de 2 ml de medio completo y con cuidado el uso de una pipeta de 5 ml para triturar la mezcla hasta que las células están en suspensión. La transferencia de células a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Añadir 40 ml de un 10 acciones mg / ml DNAsa e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vortex brevemente y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. </li><li> Desechar el sobrenadante y lavar pellet con 1 ml de medio completo de cultivo de tejidos. Repito, pues suspender las células en 2 ml de medio completo de cultivo de tejidos. </li><li> Contar las células con un hemocitómetro, o contador celular automático y ajustar la concentración de 2,5 x 10 6 células / ml. Para esta demostración un BioRad TC10 contador celular automático fue utilizado. </li></ol> 2. Formación de gotas colgantes. <ol><li> Quite la tapa de un plato de cultivo de tejidos de 60 mm y colocar 5 ml de PBS en el fondo del plato. Esto actúa como una cámara de hidratación. </li><li> Invertir la tapa y el uso de una pipeta de 20 l de depósito l 10 gotas en la parte inferior de la tapa. Asegúrese de que las gotas se colocan lo suficientemente separados para que no toque. Es posible colocar al menos 20 gotas por plato. </li><li> Invertir la tapa sobre el PBS cámara llena de fondo y se incuba a 37 ° C / 5% CO 2 / 95% de humedad, controlar las gotas todos los días y se incuban hasta que las hojas de células o grupos, se han formado. Un microscopio estéreo se puede utilizar para evaluar la formación de agregados. </li><li> Una vez que forman las hojas, que pueden ser transferidos a fondo redondo coctelera frascos que contienen 3 ml de medio completo y se incubaron en un baño de agua agitando a 37 º C y 5% de CO 2 hasta que se formen esferoides. </li></ol> 3. Notas <ol><li> Dependiendo del tamaño de la célula, la concentración puede ser necesario ajustar hacia arriba o hacia abajo. </li><li> Las células pueden ser teñidas con colorantes fluorescentes membrana intercalar antes de la formación de gota. </li><li> Dos diferentes tipos de células pueden ser diferenciada de colores y mezclados en una relación 1:1 (u otros) la relación antes de la formación de gotas colgantes. Estas pueden ser las células del cáncer y del estroma, tejidos de embriones o células manipuladas genéticamente para tener firmas específicas adhesivo. </li><li> Las células pueden separarse de los platos de cultivo de tejidos con 0,05% de tripsina / 2 mM de calcio para preservar la función cadherina. </li><li> Dependiendo del experimento, los tamaños de hoja pueden ser medidos, o agregados pueden ser utilizados para los ensayos mecánicos o para el análisis bioquímico y molecular. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Hoja o la formación de esferoides se produce normalmente dentro de las 24 horas, pero puede tomar más tiempo dependiendo del tipo de célula. La figura 1 representa las imágenes capturadas después de 18 horas de incubación de tratar el cáncer de próstata LyLu MAT (MLL), las células en la cultura colgantes caída (Figura 1) o las células tratadas con 25 micras inhibidor de MEK PD98059. Tenga en cuenta que los resultados del tratamiento Meki en una compactación marcada de la capa celular. La compactación se puede cuantificar midiendo el tamaño de 10-20 (o más) que cuelgan gotas y la comparación de tamaño medio entre los grupos de tratamiento. Por lo general analizar las imágenes utilizando el software ImageJ umbral por cada imagen a continuación, convertir imágenes a modo binario, con lo cual se aplica el análisis de partículas para revelar el área total de la imagen en píxeles. Esto puede ser fácilmente convertido en micrones cuadrados. La Figura 2 representa una comparación de tamaño de las células no tratadas y Meki MLL tratados. Como se ha indicado, el tratamiento Meki reduce significativamente el tamaño de hoja, en comparación con la t de Student-test (P &lt;0,0001). Para esta comparación, 10 agregados para cada una de las células tratadas y no tratadas se midieron. La figura 3 representa un esferoide de pollo hígado embrionario formado después de 24 horas en colgar la cultura de caída y dos días en un baño de agitación. La prueba de gota también puede ser modificado para incluir más de un tipo de células para revelar el posicionamiento espacial adoptada. Por ejemplo, las células de embriones de pollo de hígado puede ser aislado, se tiñeron con un fluorescente membrana intercalante tinte y se mezclan con las células de pollo corazón embrionarias que han sido teñidas con un colorante fluorescente diferente. Figura 4 muestra que en lugar de permanecer mezclados, las células del hígado y el corazón tienden a "una especie de salida" de unos a los otros y adoptar una esfera dentro de una esfera de configuración en la que las células del corazón están envueltas por las células del hígado. Esta configuración puede ser explicado por diferencias en la adhesión intercelular entre células del hígado y del corazón. Este concepto está codificado en la hipótesis de adhesión diferencial que se ha utilizado para explicar el comportamiento de clasificación de células de tejido embrionario entre la capa de germen de anfibios y tres embriones de teleósteos 4, para la organización de células de los islotes pancreáticos y 5 de clasificación de células entre dos poblaciones de células idénticas in todos los demás aspectos que para los niveles de expresión del mismo tipo de cadherina (6 y Figura 4B). Este resultado es particularmente importante para demostrar cómo la ingeniería una simple diferencia de adherencia entre las poblaciones de células puede resultar en la generación de la estructura del órgano, por ejemplo, un islote del páncreas 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Imágenes de las células se incubaron en la cultura colgantes caída durante 18 horas ya sea en ausencia (A) o presencia (B) de 25 micras de los inhibidores de MEK PD98059. Las imágenes fueron capturadas con una Nikon Eclipse TE 300 microscopio de epifluorescencia y Fotometría CoolSnap cámara ES digital. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cuantificación de Meki inducida por la compactación de la rata las células de cáncer de próstata MLL. Colgando culturas gota de células MLL tratados y Meki tratados se incubaron durante 18 horas después de lo cual el tamaño total se determinó como se describió anteriormente. El análisis estadístico de tamaño de los agregados fue por la t de Student prueba. El asterisco representa una diferencia estadísticamente significativa en el tamaño de los agregados (P &lt;0,0001) entre las células no tratadas y tratadas Meki y sugiere que el tratamiento con Meki en agregados significativamente más pequeños y compactos. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un esferoide formado mediante la incubación de las células de embriones de pollo en el hígado colgando cultura gota durante 18 horas después en una estufa / baño de agitación durante 48 horas. Esta imagen fue tomada usando un microscopio estereoscópico Nikon SMZ800 y una cámara CCD Sony Negro. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Colgantes cultura caída revela la clasificación de espera entre el comportamiento de diferentes tipos de células. En el panel A, las células de embriones de pollo hígado se tiñeron con PKH-2 membrana colorante intercalante y mezclado en proporciones iguales con PKH-26 células de pollo teñidas corazón embrionario. En el panel B, dos N-cadherina-transfectadas clones de células L (LN4 y LN2a), que expresan N-cad en su superficie en una proporción de 2,4:1, se tiñeron también con los tintes fluorescentes membrana intercalando PKH-2 y PKH 26 , (Sigma-Aldrich), mezclado en proporciones iguales y se cultivan como gotas colgando 7. Después de 18 horas en cultivo, las hojas de la célula fueron trasladados a frascos de agitación y se incubó durante otras 48 horas. Los agregados fueron fijadas en paraformaldehído al 2% en tampón fosfato salino y se ve con un BioRad MRC600 sistema de escaneo láser confocal microscopio conectado a una Nikon Optiphot-2 microscopio. Secciones ópticas de los canales verde y rojo fueron recogidos y una estación de trabajo de Silicon Graphix Carmesí VGX equipado con Vital Images Voxel Ultra View software de imagen se utiliza para asignar colores falsos para ambos canales y para fusionar las imágenes, revelando las configuraciones anatómicas generado. (A) sección óptica confocal a través de un envolvimiento total que demuestra de las células del corazón (aquí, en un pseudo-color amarillo) por las células hepáticas en pseudocolor azul (de 8). (B) Sección óptica confocal a través de un envolvimiento total de demostración de alta de N-cadherina células que expresan (verde) por los que expresan niveles más bajos de N-cadherina (rojo) (de 6).

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</ol>

Los estudios han demostrado que el cultivo de células en un contexto de tres dimensiones (3D) produce la morfología celular y la señalización distinta en comparación con un rígido de dos dimensiones del sistema de cultivo (2D) 9. Por ejemplo, poblada de fibroblastos-geles de colágeno demostrar que la morfología de fibroblastos en 3D es muy distinta de la observada en 2D 10,11. Del mismo modo, la cultura 3D puede inducir la diferenciación de tejidos específicos de las células epiteliales mamarias. L...

<ul><li> contador de células automático (BioRad TC10) </li><li> sacudiendo baño de agua con CO 2 Modelo trata de dos aguas 3540 (Lab-line) </li></ul>

una simple gota colgante celular cultura protocolo para la generación de esferoides 3d

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Los estudios de la cohesión célula-célula y la adhesión célula-sustrato históricamente han llevado a cabo en cultivos de monocapa adherida a sustratos rígidos. Las células en un tejido, sin embargo, suelen ser encerrado dentro de una masa de tejido muy juntos en el cual las células establecer conexiones íntimas con muchos casi vecinos y con componentes de la matriz extracelular. En consecuencia, el entorno químico y físico experimentado por las fuerzas de las células en un tejido 3D son fundamentalmente diferentes de las experimentadas por las células cultivadas en cultivo en monocapa. Esto se ha demostrado que el impacto notablemente la morfología celular y la señalización. Varios métodos han sido diseñados para generar culturas de células en 3D incluyendo encapsulación de células en geles de colágeno o un biomaterial en andamios 2. Estos métodos, aunque útiles, no recapitulan la íntima directa célula-célula arquitectura de adhesión se encuentra en los tejidos normales. Por el contrario, más de cerca los sistemas de aproximación de la cultura en la que las células individuales están más o menos dispersas dentro de una malla 3D de productos de ECM. Aquí se describe un método simple en el cual las células se colocan en la cultura colgantes caída y se incubaron en condiciones fisiológicas, hasta que la verdadera forma de esferoides 3D en el que las células están en contacto directo con ellos y con componentes de la matriz extracelular. El método no requiere equipo especializado y puede ser adaptado para incluir la adición de cualquier agente biológico en cantidades muy pequeñas que pueden ser de interés en el esclarecimiento de los efectos en la célula-célula o la interacción célula-ECM. El método también puede utilizarse para el co-cultivo de dos (o más) de diferentes poblaciones de células con el fin de dilucidar el papel de las interacciones célula-célula o célula-ECM en la especificación de las relaciones espaciales entre las células. Célula-célula la cohesión y la adhesión célula-ECM son los pilares de los estudios de desarrollo embrionario, la interacción, las células tumorales del estroma en la invasión maligna, la cicatrización de heridas, y para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Este sencillo método proporcionará un medio de generar tejido como agregados celulares para la medición de las propiedades biomecánicas o para el análisis molecular y bioquímico en un modelo fisiológicamente relevantes.

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Los estudios sobre la cohesión célula-célula y la adhesión célula-sustrato se han realizado históricamente en cultivos monocapa adheridos a sustratos rígidos. Las células ...

El objetivo de este experimento es generar esteroides tridimensionales similares a tejidos. Esto se logra primero recolectando células cultivadas y luego generando una suspensión de células individuales. A continuación, se depositan gotas de la suspensión celular en la parte inferior de la tapa invertida de un recipiente de cultivo de tejidos.Luego, la tapa se invierte sobre la cámara de hidratación. El paso final consiste en incubar las gotas colgantes durante 24 a 48 horas para permitir la formación de agregados. Estos luego pueden transferirse a un baño de agua agitado e incubar durante hasta cinco días más.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran diferencias en la cohesión de agregados o en la organización celular mediante ensayos de compactación, análisis de la simetría de la superficie del tejido o microscopía de epifluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el cultivo convencional de tejidos en 2D, por ejemplo, es que las células cultivadas en 3D imitan más de cerca las interacciones celulares que experimentan las células en un entorno tisular. Demostraré este método para mostrarles que es tan sencillo que hasta un investigador principal puede realizarlo.Para comenzar este experimento, recolecte células adherentes al 90 % de confluencia. Primero, aspire el medio de cultivo y enjuague la capa celular dos veces con PBS. Luego, aspire el PBS y pipetee dos mililitros de tripsina al 0,05 % en solución de EDTA sobre la capa monocapa.Coloque la placa en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius e incube hasta que las células se desprendan. A continuación, retire la placa del incubador y detenga la ización. Añadiendo dos mililitros de medio completo.Utilice una pipeta de cinco mililitros para triturar la mezcla hasta que las células estén completamente en suspensión. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Pipetee 40 microlitros de una solución de ADN de 10 miligramos por mililitro en la suspensión celular e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos tras la incubación.Vortex la suspensión celular brevemente y luego centrifugue a 200 veces la gravedad durante cinco minutos. Una vez finalizada la centrifugación, aspire el sobrenadante S y deséchelo, luego resuspenda el botón en un mililitro de medio completo para lavar. Repita la centrifugación y resuspenda el botón en un mililitro de medio completo.A continuación, realice un recuento celular utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro. Ajuste la suspensión celular con medio a una concentración final de 2,5 × 10⁶ células por mililitro. Luego, proceda a la formación de gotas colgantes.Prepare una cámara de hidratación retirando la tapa de una placa de cultivo celular de 60 milímetros y pipeteando cinco mililitros de PBS en el fondo de la placa. Invierta la tapa de la placa y pipetee hasta 2010 microlitros de gotas de suspensión celular en la parte inferior de la tapa. Asegúrese de colocar las gotas lo suficientemente separadas para que no se toquen.Coloque suavemente la tapa que contiene los cultivos por goteo de nuevo sobre la base del recipiente que contiene PBS. Coloque la placa de cultivo en una incubadora de cultivos de tejidos, a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono y 95 % de humedad, e incube durante la noche.Monitoree las gotas diariamente y continúe la incubación hasta que se formen láminas celulares o agregados. Una vez que se hayan formado láminas celulares o agregados, transfiérelos a matraces esféricos de vidrio con fondo redondeado que contengan tres mililitros de medio completo. Incube los matraces que contienen las láminas celulares o agregados en un baño de agitación acuoso.Mantenido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas hasta que la formación de esteroides pueda visualizarse bajo un microscopio estereoscópico. Una vez que se han formado los esteroides, el efecto de las manipulaciones experimentales sobre la formación de esteroides puede cuantificarse según el procedimiento descrito en el protocolo escrito. Además, ahora puede visualizarse la intercalación en la membrana de cualquier colorante fluorescente previamente incluido mediante microscopía de fluorescencia.Esta imagen de microscopía de campo claro muestra la agregación de células de cáncer de próstata de rata MLL tras 18 horas de incubación mediante el método de gota colgante. Esta imagen muestra un segundo agregado de células MLL formado tras 18 horas de cultivo utilizando el método de gota colgante. Estas células se cultivaron en presencia de 25 micromolar del inhibidor de MEK PD 9 8 0 5 9, lo que resultó en un agregado de células sustancialmente más compacto.Aquí se muestra la diferencia entre el cultivo en gota colgante de MLL tratado con inhibidor de MEK, el tamaño del agregado y el tamaño del agregado control no tratado. El asterisco representa una diferencia estadísticamente significativa con un valor de P menor a 0,0001. Según se determinó mediante la prueba t de Student entre agregados no tratados y tratados con inhibidor de MEK, esto sugiere que el tratamiento con inhibidor de MEK da como resultado agregados significativamente más pequeños y más compactos.Esta imagen fue capturada utilizando un microscopio estereoscópico Nikon Smz 800 e ilustra un esteroide formado al incubar células hepáticas de embrión de pollo en cultivo por gota colgante durante 18 horas. Luego, en un baño de agua agitado a 37 grados Celsius durante 48 horas. Esta imagen de microscopía confocal demuestra el comportamiento de separación que ocurre cuando ciertas poblaciones celulares se cultivan conjuntamente mediante el método de gota colgante; antes de proceder al cultivo por gota colgante, las células hepáticas de embrión de pollo fueron teñidas con el colorante pkh dos para recubrimiento intermembranal y embrión de pollo.Las células cardíacas fueron teñidas con PKH 26. Las suspensiones celulares se mezclaron luego mediante la técnica de gota colgante. Se realizó el cultivo durante 18 horas, seguido de 48 horas de incubación en baño de agua agitado a 37 grados Celsius.Puede observarse en la sección óptica que las células cardíacas coloreadas en amarillo están envueltas por células hepáticas. Aquí pseudocoloreadas en azul, dos nardi y clones de células L transfectadas que expresan NCA en sus superficies. En una proporción de 2,4 a 1, se tiñeron con los colorantes fluorescentes de membrana PKH2 y PKH26 mezclados en proporciones iguales y se cultivaron en gotas colgantes como antes.En este ejemplo, las células expresoras de cadian de alto nivel, que se muestran con pseudocolor verde, están envueltas por aquellas que expresan niveles más bajos de en cadian, que se muestran con pseudocolor rojo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos o menos si se lleva a cabo correctamente.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Los esferoides son un tipo de modelo de cultivo celular en 3D que se utiliza para representar con mayor precisión el entorno de una célula en comparación con los modelos monocapa de cultivo celular en 2D. En el protocolo de ejemplo, veremos a los científicos generar esferoides a partir de una línea celular de cáncer colorrectal y aplicar imágenes de células vivas para rastrear el crecimiento de los esferoides.

Generación de esferoides a partir de líneas celulares: un método de cultivo celular tridimensional (3D)

Este video describe la técnica de generación de esferoides tridimensionales a través del método de gota colgante utilizando células de melanoma. El modelo esferoide organotípico de melanoma tridimensional (3D) generado in vitro puede describir la arquitectura in vivo del melanoma maligno y puede proporcionar información sobre las interacciones intratumorales.

Método de la gota colgante: una técnica para generar esferoides de melanoma en 3D

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Presentamos un dispositivo microfluídico centrífugo motorizado que puede cultivar esferoides celulares. Usando este dispositivo, los esferoides de uno o varios tipos de células podrían ser fácilmente cocultivos bajo condiciones de alta gravedad.

Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares

El presente protocolo describe una técnica para producir esferoides tisulares a gran escala de forma rentable utilizando un dispositivo similar a un sello impreso en 3D.

Generación de esferoides de tejido a través de un dispositivo similar a un sello impreso en 3D

Presentamos un protocolo para el cultivo de esferoides de alta reproducibilidad y su caracterización fenotípica mediante captura de imágenes y proteómica.

Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

Este estudio presenta una metodología rentable y eficiente para generar estructuras celulares en 3D utilizando un sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. El sistema promueve la formación de esferoides/organoides uniformes, mejorando así las interacciones celulares. Este enfoque reduce la variabilidad experimental y apoya las aplicaciones en pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos.

Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

Aprende a generar esferoides 3D mediante cultivo en gota colgante para estudiar interacciones celulares. Este método rápido permite evaluar diferencias en la cohesión y clasificación celular en biología celular.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

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