Name: La presurización impulsivo de las células neuronales para el Estudio de lesión cerebral traumática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a presurizar impulsivamente células neuronales para estudiar lesión cerebral traumática usando el dispositivo Kolsky. Este método permite evaluar daño celular y mecanismos de lesión con control preciso de presión y duración.

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Los autores desean agradecer a las fuentes de financiación: Ejército-UNL Centro de Mecánica de Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Chandra nama), Premio Layman UNL (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).

1. Cultivo de células neuronales <ol><li> Las células del cerebro, incluyendo las células neuronales, los astrocitos, y sus compañeros de la cultura-puede ser utilizado como un modelo de celular. Como una demostración de viabilidad, la presurización impulsivo de la línea celular las células neuronales se presenta. </li><li> SH-SY5Y células de neuroblastoma humano (ATCC CRL-2266) se cultivaron en cubreobjetos de vidrio 18 mm de diámetro. Las células se sembraron a una densidad de 3 × 10 3 células / cm 2 a través de los medios de cultivo compuesto por DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% y el 1% de penicilina-estreptomicina. Diapositivas de células cultivadas de vidrio se mantienen en un 5% de CO 2 humidificado incubadora a 37 ° C. </li><li> Para obtener la diferenciación de las células neuronales de la SH-SY5Y células, las células se tratan con los medios de comunicación más suplementado con 10 mM de ácido retinoico (RA) durante 7 días con los medios de comunicación cambian cada dos días. El día 7, las células están listos para ser presurizada. </li></ol> 2. Equipos de presurización: Kolsky Bar <ol><li> La barra de Kolsky, desarrollado por Kolsky 1 en 1949, se ha utilizado para medir las propiedades mecánicas de un material a una velocidad de carga muy alta. El aparato consiste en dos barras con una muestra de puesta en contacto entre las barras. Una onda de tensión, creado en la barra incidente, se propaga a la muestra, donde la ola se divide en una onda reflejada y transmitida. El estrés en la muestra es proporcional a la onda transmitida. En este estudio, utilizamos una cámara de presurización de células que se coloca entre las dos barras de la Kolsky set-up. </li><li> Las dos barras de aleación de aluminio (de largo cada uno de 6 m) están suspendidos por cojinetes de bronce alineados, y uno en la cámara de presurización de células in vitro se encuentra entre las barras. La barra de arriba es la barra incidente con una masa de 130 libras sujeta en un extremo. Una abrazadera de la fricción se coloca en una posición que le dará la duración del pulso deseado. Al participar de la abrazadera y el endurecimiento de un gato tijera entre la masa y un soporte de carga, la sección de pinza de masa de la barra incidente es pre-comprimido al nivel deseado. Obligar a un tornillo con muescas que bloquea la pinza a una ruptura repentina con un sistema hidráulico libera la compresión pre-almacenar rápidamente y por lo tanto genera un pulso de presión. Esta se propaga a través de la barra incidente, impulsa el pistón cámara de prueba, y presuriza el líquido y células dentro de la cámara de forma impulsiva. La presurización de la cámara a su vez inicia un pulso de presión que se propaga en el bar de abajo de transmisión. Las tensiones asociadas con los pulsos de presión en las barras se miden con indicadores compuestos de alta resistencia a la deformación emocionados de 45 voltios. Las señales de calibre se registran con un osciloscopio digital con una frecuencia de 1 MHz como una historia de carga. </li><li> En la cámara de presurización de células in vitro se compone de un cilindro-pistón. El cilindro cuenta con 2,6 cm de diámetro interior y 3,8 cm de diámetro exterior, y tiene un pequeño agujero roscado en la base de la cavidad. El orificio sirve como un aire y la salida el exceso de líquido durante la instalación de células de la muestra. El pistón es de 7,5 cm de largo y está hecha de la materia misma barra. El pistón se envuelve con dos o tres capas de (teflón) cinta de plomero que sirven como sello de baja fricción. La tapa es de 32 mm de largo y tiene dos pequeños tornillos de acero inoxidable que aseguran el cubreobjetos de vidrio (en el que las células son cultivadas) durante la carga. </li></ol> 3. La presurización impulsivo de las células neuronales <ol><li> Todas las partes de la cámara de presurización se esterilizan utilizando el autoclave y se mantienen bajo la luz ultravioleta. El montaje de la cámara se lleva a cabo dentro de la campana de cultivo celular. El tornillo de purga en la cámara es ligeramente involucrados en la toma de aire en la base de la cavidad. Pre-caliente (37 ° C) medio fresco de crecimiento es una pipeta en la cámara sin hacer burbujas. Entonces, un portaobjetos de vidrio cultivo celular se recoge, y se coloca en la tapa del pistón (las células que enfrentan fuera). La celebración de pequeños tornillos se aprietan hacia abajo en la diapositiva para mantenerlo en su lugar. El pistón con una lámina de vidrio cultivo celular se introduce un poco en la cavidad de la cámara y el montaje se inclina con el respiradero está en el punto más alto. El tornillo de purga se elimina y el émbolo se empuja en la primera cavidad forzar las burbujas de aire, el exceso de líquido. Una referencia de marca o de una plantilla se utiliza como una guía para asegurar la misma cultura volumen de los medios para cada prueba. La dimensión axial de los medios de comunicación en la cámara es de unos 6 mm. Desinfectar el tornillo de purga y reemplazarlo para que el agua cámara hermética. La cámara no debería filtrarse bajo esta carga estática, si lo hace, la envoltura de teflón debe ser sustituida o reforzada. </li><li> En este punto, el sistema de barras Kolsky se restablece. La gran masa se mueve hacia atrás a la posición original y un perno de bloqueo nueva reemplaza a la usada (rota) una. Participar el perno de cierre nuevo con el sistema hidráulico de alrededor de 200 psi. Use el gato tijera para comprimir la sección de pre-carga de la barra incidente hasta un poco de presión más alta que el valor deseado, y luego otra vez que fuera a participar de la fricción total deltornillo de gato. La adquisición de datos está ahora armado. </li><li> La cámara de presurización celular ensamblado se instala en el sistema. Se coloca en un bloque V con el apoyo de pequeño gato tijera de laboratorio y en línea con las dos barras. Grasa cada interfaz con una capa de grasa de la luz y frote la superficie de embestir juntos para eliminar los vacíos de aire en el medio. </li><li> La prueba está listo para proceder. El tornillo de bloqueo del cabezal se ve obligado a romper rápidamente el bombeo por el conductor pinza hidráulica. La pinza se separarán y la adquisición de datos debe mostrar los resultados. La historia de presurización celular se determina a partir de las mediciones del indicador de barra de transmisión. Si la barra de transmisión utilizado es el tiempo suficiente, esto sólo debería ser a partir de la primera perturbación al punto en que las mediciones muestran una presión negativa. La duración del pulso transmitido puede ser inferior a la del pulso incidente si una burbuja se encuentra atrapada. La magnitud no puede llegar a que el pulso incidente, pero debería haber una meseta bastante largo antes de la descarga. De lo contrario, ya sea una gran burbuja de aire en la cámara sellada o un desajuste entre la asamblea y un bar podría haber ocurrido. </li><li> La cámara de presurización de células se retira y desmontar el interior de la campana de cultivos celulares. El tornillo de purga se elimina y el pistón se desprendió de la cámara. La lámina de vidrio cultivo celular se toma del extremo del pistón. </li></ol> 4. Evaluar el comportamiento celular a presión <ol><li> Después de la presurización, las células pueden ser inspeccionados inmediatamente o se incubaron para su posterior examen. Con una adecuada operación de los procesos de asepsia, a largo plazo después de la incubación es posible. </li><li> Las células a presión puede ser examinada por todas las técnicas de biología molecular y celular. Específicamente para la presurización de las células neuronales, para investigar la fisiología celular y molecular de las condiciones de TBI, los ensayos de evaluación de la presión inducida por los cambios en el crecimiento de las neuritas, cambiar los microtúbulos del citoesqueleto, la expresión génica neuronal, apoptosis, etc, se puede realizar. Como muestras de control de células, las células que se cultivan los mismos, mantienen en el interior de la cámara de presurización para el mismo período de tiempo, pero no a presión se utilizan (llamado así, el control de la cámara). </li><li> Para evaluar los cambios en el crecimiento de las neuritas, las células de control de presión y la cámara se examinan con el microscopio óptico inmediatamente después de la presurización y 1 y 24 horas de post-incubación. Un ejemplo de las imágenes de las células neuronales se muestran en la sección "Resultados Representante" (Figura 2). El cambio de longitud neurite se puede cuantificar mediante tinción de actina de inmunofluorescencia y análisis de imágenes. Las células se fijan con una solución de paraformaldehído al 4% w / v, se aclara con un 0,05% v / v de Tween-20 tampón de lavado, y permeabilized con un 0,1% v / v Triton X-100 solución. Después de bloquear con una solución al 1% w / v de albúmina sérica bovina, las células se incubaron con isotiocianato tetrametilrodamina (TRITC)-conjugado phalloidin. Imágenes de inmunofluorescencia de las células son tomadas con un microscopio de fluorescencia y las longitudes de los axones de las células a presión y el control se cuantificó mediante el software ImageJ (NIH). </li><li> Las neuritas pueden ser identificados como los axones o dendritas. Para evaluar los cambios morfológicos en los axones o dendritas, los experimentos descritos anteriormente pueden ser repetidos por el uso de anticuerpos para detectar cada estructura, es decir, neurofilamentos (NF) de anticuerpos de los axones y la proteína asociada a los microtúbulos (MAP2) de anticuerpos de las dendritas. </li><li> Los microtúbulos son uno de los principales componentes del citoesqueleto de las neuronas, y el daño a los microtúbulos se ha utilizado como un marcador de lesión neuronal. 2 microtúbulos se puede visualizar immunofluorescently el uso del anticuerpo β-tubulina. Las células se fijan después de 0 y 24 horas de post-presurización, teñidas con anticuerpos β-tubulina, y observada por el microscopio de fluorescencia. </li><li> Para evaluar el efecto de la presurización impulsiva sobre la expresión genética neuronal y apoptosis, el ARN total se extrae de las células de presión y control. La expresión génica puede ser examinada mediante la realización de RT-PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR, similar a los protocolos publicados. 3 </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un ejemplo de perfil de presión aplicado a las celdas dentro de la cámara de presurización. El aparato de barra Kolsky éxito genera nivel 2 MPa, para un pulso único de presurización tipo impulsivo, con una duración de alrededor de 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un ejemplo de la respuesta neuronal a la presurización impulsivo. SH-SY5Y células expuestas a la presurización impulsivo a 2 MPa muestran distintas neurita / axón ruptura en relación con las células de control de la cámara. 6. Dificultades y soluciones <ol><li> Cámara de sellado es uno de los principales obstáculos a superar. Es porund que los discos de ancho, con juntas tóricas tiene un problema de la especulación y el aumento de la fricción. Con el fin de eliminar los efectos de fricción, así como prevenir la especulación, un simple método de grabación de pistón con cinta de teflón fontanero se utiliza. Esto resuelve los problemas y produce el nivel deseado de presión y la duración. </li><li> Comportamiento a presión de las células neuronales, especialmente cuando se evalúa mecanismo secundario TBI o efectos a más largo plazo, deben ser examinados después de un largo post-tiempo de incubación. La cámara de la celda que contiene está expuesta a condiciones potencialmente no estéril mientras se mueve a la barra de Kolsky, presionar y mover de nuevo a la capilla de cultivo celular. Con la pre-esterilización de las piezas de cámara y un funcionamiento adecuado en el montaje / desmontaje de la diapositiva cultivo celular y la cámara interior de la campana de cultivo de células, a largo plazo después de la incubación es posible hasta varias semanas. </li><li> La reproducibilidad de los datos es un parámetro importante en el celular experimentos de estimulación mecánica. De nuestro dispositivo, la reproducibilidad de la respuesta de las células neuronales se determina cómo el perfil deseado de presurización impulsivo, en el nivel de presión y la duración, se obtuvo reiteradamente. Ya que registrar el perfil de presión obtenidos para cada uno de presurización, los datos de respuesta de las células del perfil de presión no deseados se pueden excluir manualmente después. </li><li> Los pasos de presurización todo, incluido el montaje de cámara, transferencia y montaje en la barra de Kolsky, presurización, traslado de regreso, y la cámara de desmontaje, en menos de 10 min. La diapositiva de células cultivadas siguiente se puede presurizar inmediatamente después de la presurización anterior. Por lo tanto, un número suficiente de ensayos de presurización se puede completar de manera eficiente. Nuestra puesta a punto utiliza 18 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro. Uno de los experimentos de presurización no proporciona suficientes proteínas para inmunotransferencia debido al tamaño de sustrato (y también en parte porque algunas de las células a presión están muertos). Alrededor de tres experimentos de presurización repetidos proporcionar la cantidad de proteínas necesarias para inmunotransferencia. Una vez más, la reproducibilidad se comprueba cada vez con el perfil de presión. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Muchas técnicas experimentales in vitro se hayan realizado para estudiar el daño de las células cerebrales en las condiciones de TBI. Estos incluyen la neurona / astrocito estiramiento, inducida por el flujo esfuerzo cortante, bajar de peso, laceración lápiz láser transección, litotricia, etc 4,5 Se ha asumido que la corta duración de sobrepresión es un factor dominante física para la LCT. Especialmente 6,7 , la onda expansiva de la explosión TBI tiene una duración de pulso de una orden de milisegundos. 4 Basado en esta hipótesis y la observación, la cámara de barómetro capaz de presurización transitorio ha sido desarrollado y utilizado para evaluar el comportamiento de las células cerebrales en condiciones de TBI. Por ejemplo, en el líquido de la cámara de percusión barotrauma un impulso de presión con 20-30 ms de duración larga y un pico de presión de hasta 0,5 MPa se utilizó para examinar el comportamiento humano de células gliales en la LCT. 6 Recientemente, VandeVord et al. 7 metal usado bola de cámara sorprendente barómetro para examinar el comportamiento celular de astrocitos en TBI pero la bola de metal en huelga produce pulsos de presión múltiple. En este estudio, hemos desarrollado un dispositivo de presurización de la célula nueva que genera un solo pulso de presurización de tipo impulsivo. El dispositivo fue desarrollado sobre la base de la barra de Kolsky puesta en marcha, que ha sido utilizada como un aparato de ensayo de materiales en la 8 y los estudios de otros. El 1,9 bar Kolsky la capacidad de ensayo de materiales en la tasa de carga muy alta se ha modificado para poder aplicar un solo pulso de sobrepresión tipo en las células cultivadas dentro de la cámara de presurización (Figura 1). Con éxito puede controlar la magnitud y la duración de la sobrepresión impulsivo. Como una respuesta de células representativas, hemos demostrado que la presión en MPa 2 SH-SY5Y células neuronales pantalla neuritas importante y la pérdida axonal en comparación con las células sin presión cámara de control. En conclusión, hemos desarrollado un novedoso aparato impulsivo presurización de células utilizando un dispositivo especialmente diseñado Kolsky bar y demostró su potencial uso en la investigación de la respuesta neuronal en condiciones de TBI. También tomamos nota de que esta técnica es muy versátil en el que cualquier tipo de células pueden estar expuestos a las presiones impulsivas en varios niveles y la duración. Por lo tanto, el dispositivo se puede utilizar para investigar el impulsivo presión inducida por el comportamiento mecanotransducción celular, no sólo por causar lesiones a las células, sino también para estimular las células de manera positiva en su función y determinar el destino.

<table><tbody><tr><td>Células de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio de 18 mm de diámetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular: DMEM, 10% de suero bovino fetal, 1% de penicilina-estreptomicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico (10 &amp;mu;M) para inducir la neurogénesis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo impulsivo de presurización de barra de Kolsky</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de presurización celular de pistón-cilindro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tornillos de acero inoxidable para fijar el cubreobjetos con células cultivadas al pistón</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasa para las interfaces entre la cámara de células y la barra de Kolsky</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suministros generales de biología molecular para evaluar la respuesta celular a la presurización (fijador, anticuerpos, colorante fluorescente, suministros para PCR, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la presurización impulsivo de las células neuronales para el estudio de lesión cerebral traumática

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Un nuevo experimento impulsivo presurización celular se ha desarrollado utilizando un dispositivo de bar Kolsky para investigar explosión inducida por lesiones cerebrales traumáticas (TBI). Se demuestra en este artículo cómo explosión de vídeo TBI relevantes para la presurización impulsivo se aplica a las células neuronales in vitro. Esto se logra mediante el uso de un buen control de presión de pulso creado por un equipo especializado Kolsky bar, con la historia completa de presión dentro de la cámara de presurización celular registrado. Presurizado células neuronales son inspeccionados inmediatamente después de la presurización, o se incubaron para examinar los efectos a largo plazo de la presurización de impulsivo en neurite / axonal, la expresión génica neuronal, apoptosis, etc Hemos observado que la presurización impulsivo en alrededor de 2 MPa induce la pérdida de relación distinta de neuritas a las células sin presión. Nuestra técnica ofrece un nuevo método para investigar los mecanismos moleculares / celulares de la explosión TBI, a través de la presurización impulsivo de las células del cerebro en una magnitud de presión bien controlada y la duración.

Un nuevo experimento impulsivo presurización celular se ha desarrollado utilizando un dispositivo de bar Kolsky para investigar los mecanismos moleculares / celulares de la explosión inducida por la lesión cerebral traumática.

La presurización impulsivo de las células neuronales para el Estudio de lesión cerebral traumática

Se ha desarrollado un nuevo experimento de presurización impulsiva de células utilizando un dispositivo de barra de Kolsky para investigar la lesión cerebral traumática (LCT) inducida por explosiones. ...

El objetivo general de este procedimiento es administrar y observar la presurización impulsiva de células cerebrales cultivadas para el estudio de lesiones cerebrales traumáticas. Esto se logra primero induciendo la diferenciación neuronal de células cultivadas utilizando ácido retinoico. A continuación, las células neuronales se colocan en el dispositivo de presurización celular basado en el barómetro ksky y se exponen a una presión impulsiva de magnitud y duración relevantes para la lesión cerebral traumática inducida por explosión.Por último, las células se someten a ensayos de biología molecular para evaluar los daños celulares y los posibles mecanismos de lesión cerebral traumática. Los resultados del examen mediante microscopía muestran muerte celular neuronal y pérdida estructural de los axones de las neuritas tras una presurización impulsiva de magnitud de dos megapascales y duración de 0,7 milisegundos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la percusión con fluido, es que no presenta secciones de presión negativa y la duración del tiempo está bien controlada.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del traumatismo craneoencefálico (TBI), como el umbral de muerte celular neurológica o lesión en función de la presión impulsiva, magnitud, duración y forma de carga. Aunque este método ha sido utilizado hasta ahora en nuestro grupo para estudiar el TBI inducido por explosión, también puede emplearse en otros tipos de traumatismo craneoencefálico, como el TBI inducido por impacto. El procedimiento será demostrado por Matthew, un estudiante de posgrado del Laboratorio de la Profesora Chen fang, y por li ha, una técnica de mi laboratorio.Este experimento utiliza un conjunto de barras Ksky configurado como un aparato de presurización celular. El aparato consta de dos barras de aleación de aluminio de seis metros suspendidas mediante rodamientos de latón alineados, con una cámara de presurización celular in vitro. Situada entre las barras, la cámara de presurización celular está compuesta por un cilindro de pistón.El cilindro tiene un pequeño orificio roscado en la base de la cavidad, que durante la instalación de la muestra celular permite la salida de aire y el exceso de fluido. El pistón está fabricado con el mismo tubo que la barra y está envuelto con dos o tres capas de cinta de teflón. La tapa final fija las laminillas de vidrio con dos pequeños tornillos de acero inoxidable.Esta demostración utiliza células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Sin embargo, el protocolo es aplicable a muchos modelos celulares en cultivo. Las células se siembran sobre cubreobjetos de vidrio de 18 milímetros de diámetro a una densidad de 3000 células por centímetro cuadrado.En DMEM suplementado, mientras se incuban las células, desencadene su diferenciación suplementando el medio con ácido retinoico 10 micromolar durante siete días, cambiando el medio cada dos días. En el séptimo día, las células muestran una estructura axonal de neurita bien desarrollada y están listas para ser presurizadas. Esterilice todas las partes de la cámara de presurización utilizando un autoclave y guárdelas bajo luz ultravioleta mientras ensambla la cámara.En una cabina de cultivo, asegúrese de que el tornillo de ventilación en la cámara esté ligeramente ajustado en la ventilación de aire. En la base de la cavidad, llene la cámara con medio de crecimiento tibio recién preparado. Luego, atornille una placa de vidrio con cultivo celular en la tapa del pistón, con las células orientadas hacia afuera, e introduzca cuidadosamente el pistón en la cavidad de la cámara.Retire el tornillo de ventilación, incline la ventilación hacia arriba y empuje el pistón hacia la cámara hasta una línea de referencia determinada previamente. Esto deja aproximadamente seis milímetros de profundidad de fluido dentro de la cámara de presurización. Evite introducir burbujas, sane el tornillo de ventilación y colóquelo nuevamente para hacer la cámara hermética al agua.La cámara no debe tener fugas bajo la carga estática. Reinicie el sistema de barras Ksky. Devuelva la masa pesada a su posición original y reemplace el perno de bloqueo.El perno de bloqueo mantiene una fuerza de sujeción que impide el movimiento de la barra incidente hasta que los pasadores se rompen. Accione el nuevo perno de bloqueo con el gato hidráulico hasta aproximadamente 200 lb/pulg². Utilice el gato de tijera para comprimir la sección de precarga de la barra incidente hasta una presión ligeramente superior al valor deseado, y luego relájelo para activar por completo la fricción del tornillo JAK. Ahora configure la adquisición de datos, ya que la presurización dura aproximadamente un milisegundo.Establezca una frecuencia de muestreo de un megahercio utilizando galgas extensométricas de 2000 ohmios en un circuito de puente de Wheatstone. El voltaje debe ajustarse a 45 voltios en la barra transmisora. Monte la cámara de celda con el pistón orientado hacia la barra transmisora.Coloque la cámara de la celda en un bloque en V sostenido por el gato de tijera pequeño del laboratorio y alínelo con las dos barras. Lubrique ligeramente cada interfaz y elimine cualquier aire entre las superficies en contacto frotándolas suavemente juntas. Ahora el sistema está preparado.Arme la adquisición de datos y realice la prueba bombeando rápidamente el accionador hidráulico del sujetador. Esto fuerza la ruptura del perno de bloqueo, provocando que el sujetador se separe y que una onda de presión se transmita a las células. Después de la prueba, retire la lámina de la cámara en una cabina de cultivo y proceda a evaluar el comportamiento celular.Con experiencia, el aparato puede utilizarse para presurizar aproximadamente nueve portaobjetos con cultivo celular por hora. Al analizar la señal, pueden observarse errores por burbujas de aire al inicio de la señal de barras transmitida; sin embargo, no se observan en esta demostración.Si la barra de transmitancia es lo suficientemente larga, entonces los datos más importantes deben comenzar con la primera perturbación y terminar donde las mediciones muestren una presión negativa; esta lectura de voltaje es proporcional al estrés experimentado por las células mediante el análisis con galgas extensométricas. La duración del pulso transmitido puede ser más corta que la del pulso incidente. Si se atrapa una pequeña burbuja en el fluido dentro de la cámara de presurización celular, la magnitud del pulso transmitido puede no superar la del pulso incidente, pero debería tener una meseta suficientemente larga antes de la descarga.De lo contrario, o bien una burbuja de aire grande queda atrapada en la cámara sellada o el ensamblaje y la barra están mal alineados. Después de la presurización, las células pueden inspeccionarse inmediatamente o incubarse más tiempo para su posterior examen. Compare las células presurizadas con las células de control de la cámara que fueron tratadas de manera idéntica pero no sometidas a presurización, para evaluar los cambios en la longitud de las neuritas mediante microscopía óptica en diversos puntos temporales posteriores a la incubación.La tinción inmunofluorescente de actina puede utilizarse para evaluar cambios en el citoesqueleto. También se puede usar el anticuerpo para la proteína dos asociada a microtúbulos. MAP dos puede emplearse para visualizar cambios en uno de los marcadores neuronales clave.Para evaluar el efecto de la presurización impulsiva sobre la expresión génica neuronal y apoptótica, utilice técnicas estándar de biología molecular, como la R-T-P-C-R, si se desea. Se pueden recolectar lisados celulares suficientes para inmunotransferencia a partir de varias muestras celulares presurizadas de manera idéntica. En este ejemplo, el perfil de presurización, el aparato ksky bar aplicó con éxito una presión impulsiva de tipo pulso único a nivel de dos megapascales con una duración de aproximadamente 0,7 milisegundos a las células neuronales cultivadas, como se observa en las imágenes del microscopio óptico; las células neuronales humanas SHSY cinco Y, que fueron sometidas a una presión impulsiva de dos megapascales, muestran una ruptura distinta de los neuritos y axones en comparación con las células de control no despresurizadas.Al intentar este procedimiento, siempre debe sostener la cámara de presurización de fluidos de esta manera y nunca de la siguiente, ya que sometería a las células a presión negativa después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran el mecanismo celular de la lesión cerebral traumática bajo condiciones controladas de presurización en próstata. Agradecemos el apoyo financiero del Centro del Ejército UNL para la Mecánica del Trauma.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra el procedimiento para inducir una lesión cerebral traumática de cráneo abierto en un ratón haciendo una incisión en la línea media del cráneo, perforando el cráneo y quitando el colgajo óseo para exponer la corteza cerebral, y aplicando alta presión para inducir el trauma. A continuación, se sutura la herida para preparar el modelo de ratón para experimentos posteriores.

Generación de un modelo de ratón con lesión cerebral traumática utilizando una sonda impactadora

In vitro se están desarrollando modelos de lesiones cerebrales traumáticas para reproducir una deformación del cerebro vivo. Lesiones inducidas por el estiramiento se ha empleado para astrocitos, neuronas, células gliales, la aorta, y células endoteliales cerebrales. Sin embargo, nuestro sistema utiliza una barrera hematoencefálica (BBB) ​​modelo que posee propiedades que constituyen un modelo legítimo de la acreditación para establecer un modelo in vitro de lesión cerebral traumática.

Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como<em&gt; In Vitro</em&gt; Lesión cerebral traumática Modelo de la barrera hematoencefálica

Las lesiones cerebrales traumáticas (TBI) siguen siendo un grave problema de salud. Con el modelo de cirugía de impacto cortical controlado, se pueden realizar investigaciones sobre los efectos del TCE y los posibles métodos de tratamiento.

Controlado Modelo de Impacto cortical de la lesión cerebral traumática

Este papel describe un modelo novedoso de lesión de cerebro traumática de la explosión primaria. Un tubo de descarga por aire comprimido se utiliza para exponer en vitro ratón rebanada hippocampal culturas una sola onda de choque. Este es un protocolo simple y rápido de generar una lesión de tejido de cerebro reproducible con un alto rendimiento.

Un modelo de novela In Vitro de lesión cerebral traumática por explosión

Aquí, presentamos un protocolo para describir métodos ex vivo determinación de la reactividad vascular después de una explosión primaria una lesión cerebral traumática (bTBI) con segmentos de roedores, aislado y a presión arterial cerebral media (MCA). bTBI inducción se logra mediante un tubo de descarga, también conocido como un dispositivo simulador de explosión avanzado (ABS).

Efectos de Neurotrauma inducido ráfaga en roedor a presión media de las arterias cerebrales

Aquí presentamos un protocolo para inducir TBI severo con el modelo de lesión de percusión de fluido lateral (FPI) en ratas Macho macho. También demostramos el uso de un sistema de telemetría inalámbrica para recopilar grabaciones continuas de video-EEG y monitorear las descargas epileptiformes consistentes con la epileptogénesis postraumática.

Uso de un sistema inalámbrico de video-eEG para monitorear descargas epiptiformes después de una lesión cerebral traumática inducida por percusión de fluido lateral

Aquí describimos un protocolo para la inducción de una lesión cerebral traumática murina a través de un impacto cortical controlado a cabeza abierta.

Modelo Murino de Impacto Cortical Controlado para la Inducción de Lesiones Cerebrales Traumáticas

Presentamos aquí un protocolo de un modelo de onda expansiva para roedores para investigar los efectos neurobiológicos y fisiopatológicos de la lesión cerebral traumática leve a moderada. Establecimos una configuración de sobremesa impulsada por gas equipada con sensores de presión que permiten una generación confiable y reproducible de lesiones cerebrales traumáticas leves a moderadas inducidas por explosiones.

Modelo de onda blástica de baja intensidad para la evaluación preclínica de la lesión cerebral traumática leve de cabeza cerrada en roedores

La hemorragia intraparenquimatosa y la neuroinflamación acompañada de contusión cerebral pueden desencadenar una lesión cerebral secundaria grave. Este protocolo detalla un modelo de impacto cortical controlado (CCI) en ratones, que permite a los investigadores estudiar la hemorragia, la contusión y las respuestas inmunitarias postraumáticas y explorar posibles terapias.

Un modelo preclínico de impacto cortical controlado para hemorragia traumática, contusión y neuroinflamación

Aquí se presentan métodos para producir exposiciones repetidas a explosiones de baja intensidad utilizando ratones.

Modelado de la exposición a explosiones de bajo nivel altamente repetitivas en ratones

Este protocolo describe un sistema de aire de sobrepresión personalizado diseñado para inducir lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado en ratones, incluidos traumatismos oculares, cerebrales y de la médula espinal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco para que los investigadores adapten y amplíen fácilmente el sistema para sus estudios únicos de trauma en el SNC.

Sistema para la lesión focal y cerrada del sistema nervioso central

Aprende a presurizar impulsivamente células neuronales para estudiar lesión cerebral traumática usando el dispositivo Kolsky. Este método permite evaluar daño celular y mecanismos de lesión con control preciso de presión y duración.

La presurización impulsivo de las células neuronales para el Estudio de lesión cerebral traumática

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