La presurización impulsivo de las células neuronales para el Estudio de lesión cerebral traumática

El objetivo general de este procedimiento es administrar y observar la presurización impulsiva de células cerebrales cultivadas para el estudio de lesiones cerebrales traumáticas. Esto se logra primero induciendo la diferenciación neuronal de células cultivadas utilizando ácido retinoico. A continuación, las células neuronales se colocan en el dispositivo de presurización celular basado en el barómetro ksky y se exponen a una presión impulsiva de magnitud y duración relevantes para la lesión cerebral traumática inducida por explosión.

Por último, las células se someten a ensayos de biología molecular para evaluar los daños celulares y los posibles mecanismos de lesión cerebral traumática. Los resultados del examen mediante microscopía muestran muerte celular neuronal y pérdida estructural de los axones de las neuritas tras una presurización impulsiva de magnitud de dos megapascales y duración de 0,7 milisegundos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la percusión con fluido, es que no presenta secciones de presión negativa y la duración del tiempo está bien controlada.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del traumatismo craneoencefálico (TBI), como el umbral de muerte celular neurológica o lesión en función de la presión impulsiva, magnitud, duración y forma de carga. Aunque este método ha sido utilizado hasta ahora en nuestro grupo para estudiar el TBI inducido por explosión, también puede emplearse en otros tipos de traumatismo craneoencefálico, como el TBI inducido por impacto. El procedimiento será demostrado por Matthew, un estudiante de posgrado del Laboratorio de la Profesora Chen fang, y por li ha, una técnica de mi laboratorio.

Este experimento utiliza un conjunto de barras Ksky configurado como un aparato de presurización celular. El aparato consta de dos barras de aleación de aluminio de seis metros suspendidas mediante rodamientos de latón alineados, con una cámara de presurización celular in vitro. Situada entre las barras, la cámara de presurización celular está compuesta por un cilindro de pistón.

El cilindro tiene un pequeño orificio roscado en la base de la cavidad, que durante la instalación de la muestra celular permite la salida de aire y el exceso de fluido. El pistón está fabricado con el mismo tubo que la barra y está envuelto con dos o tres capas de cinta de teflón. La tapa final fija las laminillas de vidrio con dos pequeños tornillos de acero inoxidable.

Esta demostración utiliza células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Sin embargo, el protocolo es aplicable a muchos modelos celulares en cultivo. Las células se siembran sobre cubreobjetos de vidrio de 18 milímetros de diámetro a una densidad de 3000 células por centímetro cuadrado.

En DMEM suplementado, mientras se incuban las células, desencadene su diferenciación suplementando el medio con ácido retinoico 10 micromolar durante siete días, cambiando el medio cada dos días. En el séptimo día, las células muestran una estructura axonal de neurita bien desarrollada y están listas para ser presurizadas. Esterilice todas las partes de la cámara de presurización utilizando un autoclave y guárdelas bajo luz ultravioleta mientras ensambla la cámara.

En una cabina de cultivo, asegúrese de que el tornillo de ventilación en la cámara esté ligeramente ajustado en la ventilación de aire. En la base de la cavidad, llene la cámara con medio de crecimiento tibio recién preparado. Luego, atornille una placa de vidrio con cultivo celular en la tapa del pistón, con las células orientadas hacia afuera, e introduzca cuidadosamente el pistón en la cavidad de la cámara.

Retire el tornillo de ventilación, incline la ventilación hacia arriba y empuje el pistón hacia la cámara hasta una línea de referencia determinada previamente. Esto deja aproximadamente seis milímetros de profundidad de fluido dentro de la cámara de presurización. Evite introducir burbujas, sane el tornillo de ventilación y colóquelo nuevamente para hacer la cámara hermética al agua.

La cámara no debe tener fugas bajo la carga estática. Reinicie el sistema de barras Ksky. Devuelva la masa pesada a su posición original y reemplace el perno de bloqueo.

El perno de bloqueo mantiene una fuerza de sujeción que impide el movimiento de la barra incidente hasta que los pasadores se rompen. Accione el nuevo perno de bloqueo con el gato hidráulico hasta aproximadamente 200 lb/pulg². Utilice el gato de tijera para comprimir la sección de precarga de la barra incidente hasta una presión ligeramente superior al valor deseado, y luego relájelo para activar por completo la fricción del tornillo JAK. Ahora configure la adquisición de datos, ya que la presurización dura aproximadamente un milisegundo.

Establezca una frecuencia de muestreo de un megahercio utilizando galgas extensométricas de 2000 ohmios en un circuito de puente de Wheatstone. El voltaje debe ajustarse a 45 voltios en la barra transmisora. Monte la cámara de celda con el pistón orientado hacia la barra transmisora.

Coloque la cámara de la celda en un bloque en V sostenido por el gato de tijera pequeño del laboratorio y alínelo con las dos barras. Lubrique ligeramente cada interfaz y elimine cualquier aire entre las superficies en contacto frotándolas suavemente juntas. Ahora el sistema está preparado.

Arme la adquisición de datos y realice la prueba bombeando rápidamente el accionador hidráulico del sujetador. Esto fuerza la ruptura del perno de bloqueo, provocando que el sujetador se separe y que una onda de presión se transmita a las células. Después de la prueba, retire la lámina de la cámara en una cabina de cultivo y proceda a evaluar el comportamiento celular.

Con experiencia, el aparato puede utilizarse para presurizar aproximadamente nueve portaobjetos con cultivo celular por hora. Al analizar la señal, pueden observarse errores por burbujas de aire al inicio de la señal de barras transmitida; sin embargo, no se observan en esta demostración.

Si la barra de transmitancia es lo suficientemente larga, entonces los datos más importantes deben comenzar con la primera perturbación y terminar donde las mediciones muestren una presión negativa; esta lectura de voltaje es proporcional al estrés experimentado por las células mediante el análisis con galgas extensométricas. La duración del pulso transmitido puede ser más corta que la del pulso incidente. Si se atrapa una pequeña burbuja en el fluido dentro de la cámara de presurización celular, la magnitud del pulso transmitido puede no superar la del pulso incidente, pero debería tener una meseta suficientemente larga antes de la descarga.

De lo contrario, o bien una burbuja de aire grande queda atrapada en la cámara sellada o el ensamblaje y la barra están mal alineados. Después de la presurización, las células pueden inspeccionarse inmediatamente o incubarse más tiempo para su posterior examen. Compare las células presurizadas con las células de control de la cámara que fueron tratadas de manera idéntica pero no sometidas a presurización, para evaluar los cambios en la longitud de las neuritas mediante microscopía óptica en diversos puntos temporales posteriores a la incubación.

La tinción inmunofluorescente de actina puede utilizarse para evaluar cambios en el citoesqueleto. También se puede usar el anticuerpo para la proteína dos asociada a microtúbulos. MAP dos puede emplearse para visualizar cambios en uno de los marcadores neuronales clave.

Para evaluar el efecto de la presurización impulsiva sobre la expresión génica neuronal y apoptótica, utilice técnicas estándar de biología molecular, como la R-T-P-C-R, si se desea. Se pueden recolectar lisados celulares suficientes para inmunotransferencia a partir de varias muestras celulares presurizadas de manera idéntica. En este ejemplo, el perfil de presurización, el aparato ksky bar aplicó con éxito una presión impulsiva de tipo pulso único a nivel de dos megapascales con una duración de aproximadamente 0,7 milisegundos a las células neuronales cultivadas, como se observa en las imágenes del microscopio óptico; las células neuronales humanas SHSY cinco Y, que fueron sometidas a una presión impulsiva de dos megapascales, muestran una ruptura distinta de los neuritos y axones en comparación con las células de control no despresurizadas.

Al intentar este procedimiento, siempre debe sostener la cámara de presurización de fluidos de esta manera y nunca de la siguiente, ya que sometería a las células a presión negativa después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran el mecanismo celular de la lesión cerebral traumática bajo condiciones controladas de presurización en próstata. Agradecemos el apoyo financiero del Centro del Ejército UNL para la Mecánica del Trauma.