Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

El objetivo general de este procedimiento es demostrar in vivo una microscopía fotoacústica de resolución óptica o Pam de microcirculación que no sea invasiva y no tenga etiquetas. Esto se logra anestesiando primero al animal de experimentación. El segundo paso del procedimiento es posicionar la región de interés trasladando la cabeza de imagen de la resolución óptica, se establecen los parámetros de escaneo del microscopio fotoacústico y se inicia la adquisición de la imagen.

En última instancia, las distribuciones de la concentración total de oxígeno y la saturación de oxígeno de la hemoglobina se obtienen mediante el cálculo de los datos experimentales de múltiples longitudes de onda. La microscopía fotoacústica de resolución óptica se basa en la excitación láser y la detección ultrasónica. Un rayo láser de poste corto se enfoca en el tejido biológico.

La absorción de luz genera un calentamiento transitorio y la posterior emisión ultrasónica, que se recibe para formar una imagen. La ventaja única de, o Pam, es la detección sin tierra y la exquisita sensibilidad a la absorción óptica. Por el contrario, las tecnologías existentes de microscopía de reflexión, no óptica, son principalmente sensibles a la dispersión óptica o a la fluorescencia. Capaz de proporcionar imágenes de alta resolución sin etiquetas de vacío de absorción óptica o RPM ha encontrado amplias aplicaciones biomédicas en neurología, oftalmología, biología vascular y dermatología.

La microscopía fotoacústica de resolución óptica o pamm consta de componentes ópticos y ultrasónicos. La fuente de irradiación óptica es un láser de tinte bombeado por un láser de pulso de estado sólido. El rayo láser de salida se atenúa mediante un filtro de densidad neutra y se acopla a una fibra óptica monomodo para la entrega de luz y permite el escaneo mecánico del cabezal de imagen del microscopio en lugar del objeto vivo para acoplar eficazmente el rayo láser multimodo en una fibra óptica monomodo.

Primero se filtra mediante un orificio de 50 micrómetros de diámetro. El orificio se coloca ligeramente lejos del foco de la lente del condensador para que su diámetro coincida con el diámetro del haz de modo fundamental. Para crear un foco óptico limitado casi por difracción, la salida de la fibra monomodo se coteja y llena la apertura posterior de un microscopio. Objetivo.

La detección ultrasónica implica un combinador de haz óptico acústico casero conectado a un transductor ultrasónico. El combinador alinea la irradiación óptica y la detección acústica coaxialmente. Una cavidad esférica se muele en la parte inferior del combinador para producir una lente acústica con una apertura numérica de 0,5 en agua, que proporciona un diámetro focal acústico de 43 micrómetros a la frecuencia central de 50 megahercios.

Para la primera alineación, es útil utilizar ultrasonidos de eco de pulso para determinar la posición del plano focal acústico. El cabezal de imagen se ajusta verticalmente hasta que se observa la señal ultrasónica de eco de pulso máximo. Para maximizar la sensibilidad de detección, los focos ópticos y acústicos están alineados. Confocal.

En el plano focal acústico se coloca un objetivo ópticamente absorbente, como un trozo de cinta aislante negra. A continuación, se ajusta la posición focal óptica para maximizar la señal fotoacústica. El sistema o PAM también incluye amplificadores electrónicos y convertidor digital analógico, un escáner mecánico y un controlador de escáner.

La señal digitalizada se transfiere a una computadora para la formación de imágenes. El software convierte los datos brutos en una secuencia de imágenes bcan transversales. A medida que el ráster del cabezal del microscopio escanea el objeto, las imágenes grabadas se pueden mostrar como imágenes transversales individuales, imágenes de proyección de amplitud máxima 2D o representaciones 3D.

Se utiliza un tanque de agua para alojar el cabezal de imágenes del microscopio. Una ventana de imagen se corta en una placa de Petri y se sella con una membrana de polietileno transparente ultrasónica y ópticamente. La onda fotoacústica generada por el objeto se acopla acústicamente al detector ultrasónico primero mediante gel ultrasónico entre el objeto y la membrana de polietileno, y luego mediante agua desionizada en la placa de Petri.

Estas invenciones y aplicaciones de los láseres ópticos disponibles y el transductor de ultrasonidos conforman el sistema or pam. En el siguiente segmento, obtendremos imágenes de la microvasculatura de un ratón vivo con este sistema. Si el animal que se está fotografiando no es un ratón desnudo, 24 horas antes del experimento, lo ideal es dete.

Así se recupera la irritación de la vasculatura cutánea. Anestesió al ratón con flúor ISO al 3% vaporizado en oxígeno de grado médico. El caudal típico es de entre uno y 1,5 litros por minuto.

Dependiendo del peso corporal del animal. Mantenga la anestesia con flúor ISO al 1% Durante todo el experimento, realice un pellizco en los dedos de los pies para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado. Transfiera el mouse a una etapa estereotáctica con una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 grados centígrados.

Ahora aplana la oreja en la placa de plástico. A continuación, aplique una capa de gel de ultrasonido en la parte superior de la oreja. Evite atrapar burbujas de aire dentro del gel.

También aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad o el daño accidental del láser. Evite tocar el ojo directamente con el aplicador. A continuación, coloque la oreja debajo de la ventana de imagen y eleve lentamente la etapa del animal hasta que el gel de ultrasonido entre en contacto con la parte inferior de la membrana.

Se requiere un contacto suave porque presionar el oído contra la membrana puede afectar el flujo sanguíneo en el oído. A continuación, tome algunas precauciones con el animal para controlar su estado fisiológico. Sujete un oxímetro de pulso al ratón, la pata o la cola.

Ahora baje el cabezal de imagen hasta que la lente acústica se sumerja en agua desionizada y elimine las burbujas atrapadas debajo de la lente acústica. Configure el láser en el modo de disparo externo e inicie el escaneo de prueba. Ajuste la posición Z del cabezal de imagen hasta que los focos duales óptico y acústico estén asentados en el centro del oído.

Ahora configure los parámetros de escaneo e inicie la adquisición formal de imágenes. Para medir la concentración total de hemoglobina. Establezca la longitud de onda en un punto espástico ISO donde la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina tengan coeficientes de extinción molar iguales.

Para medir la saturación de oxígeno de la hemoglobina, ajuste la segunda longitud de onda a donde los coeficientes de extinción molar de la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina tengan una diferencia pronunciada. Cuando termine, limpie la oreja del ratón y colóquelo en una incubadora. Con la temperatura ambiental establecida en 37 grados centígrados, cuando se despierte, naturalmente devuelva el ratón a la instalación de animales.

Esta imagen de proyección de amplitud máxima muestra la anatomía vascular de una oreja de ratón desnuda viva fotografiada con Pam a 570 nanómetros. Esta imagen de proyección muestra la saturación de oxígeno de hemoglobina en el mismo oído. Se calcula a partir de las imágenes adquiridas a una longitud de onda espástica ISO de 570 nanómetros y una longitud de onda dominante de absorción de desoxihemoglobina de 561 nanómetros.

Una mirada más cercana a la región en caja muestra la resolución de oramm. Un lecho capilar densamente compactado se resuelve claramente. En este video, demostramos el protocolo experimental típico para ORPM, incluida la configuración del sistema, el procedimiento experimental de alineación del sistema in vivo y el esquema de imágenes funcionales.

Uno de los aspectos más importantes en el diseño y operación del instrumento es la alineación confocal acústica óptica, que es crucial para la sensibilidad de la imagen, la microscopía fotoacústica de resolución óptica en combinación con la microscopía fotoacústica de resolución acústica de penetración profunda y la tomografía computarizada fotoacústica promete imágenes in vivo, funcionales y moleculares y múltiples escalas finales, clavos de órganos, células, tejidos, y hasta los órganos se pueden visualizar con el mismo contraste. El origen, como la escalabilidad de las imágenes, tiene el potencial de revolucionar la investigación en sistemas multiescala, biología y traducción. De los descubrimientos microscópicos de laboratorio a la práctica clínica macroscópica.