Un ensayo de bioluminiscencia de calcio para el análisis funcional de los Mosquitos ( Aedes aegypti) Y Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados a proteínas

El objetivo general del siguiente experimento es analizar las relaciones entre la estructura y la actividad de los neuropéptidos de artrópodos sintetizados sobre sus receptores acoplados a proteínas G cognatos. Esto se logra mediante la transfección de células de ovario de hámster chino, células K1 vacías, con el vector de expresión del receptor acoplado a proteínas G deseado para obtener líneas celulares estables transformadas derivadas de una sola célula. Como segundo paso, la línea celular estable se transfecta con el plásmido Quaran, que porta el gen reportero Gina Quaran para medir la bioluminiscencia intracelular en el ensayo de placa de bioluminiscencia de calcio. A continuación, se realiza el ensayo de placa de bioluminiscencia de calcio con el fin de determinar los niveles citoplasmáticos de calcio tras la aplicación del ligando peptídico a estas células recombinantes.

Se obtienen resultados que muestran diferencias en unidades de bioluminiscencia tras la aplicación de péptidos estructuralmente distintos o de diferentes concentraciones de péptidos a células recombinantes, basadas en la liberación intracelular de calcio inducida, tal como se detecta mediante el reportero una corrina en el ensayo de placa. La principal ventaja del uso de líneas celulares clonales transformadas estables que expresan receptores acoplados a proteínas G (GPCR) frente a tendencias y protocolos de expresión es que los niveles de expresión del receptor son más uniformes, lo que permite una mayor consistencia en los resultados. Además, la localización dirigida de la proteína acuarium en las mitocondrias permite mediciones sensibles de calcio mediante bioluminiscencia, demostrando que en el experimento de hoy participarán dos estudiantes de posgrado, Lie y Simon Kersch, así como un postdoctorado de mi laboratorio.

Para establecer líneas celulares estables, comience por cultivar células de ovario de hámster chino, células K1 vacías, a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono. Mantenga las células vacías en medio de crecimiento con antibiótico antimicótico 1x después de que las células estén creciendo saludablemente. Siembre las células de ovario de hámster chino K1 en matraces de cultivo tisular T25 y cultive las células durante la noche en medio de crecimiento sin antibióticos hasta que alcancen aproximadamente un 30% de confluencia.

Antes de la transfección, prepare un vector de expresión de ADN que contenga el receptor acoplado a proteína G de interés, como se describe en el protocolo escrito. Combine el ADN con 100 microlitros de medio Optum con suero reducido.

Mezcle seis microlitros de reactivo de lipofección en 100 microlitros de medio F 12 K sin suero e incube a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos. Tras la incubación, mezcle suavemente las soluciones de ADN y de lipofección gota a gota. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos en un tubo de 15 mililitros.

Mezcle suavemente la mezcla de transfección en 1,8 mililitros de medio F 12 K fresco de forma gota a gota. Luego, lave las células con PBS y añada esta nueva solución de transfección a las células. Tras una incubación de 18 horas.

Cambie el medio a F 12 K, medio con 10 % de FBS sin antibióticos e incube durante la noche el día siguiente. Divida las células en dos matraces T 25 con F 12 K, medio con 10 % de FBS sin antibióticos según lo descrito en el procedimiento escrito. Incube durante 18 horas adicionales.

Sustituya el medio por un medio selectivo. A continuación, cultive las células utilizando el medio selectivo durante tres o cuatro semanas. Esto permitirá seleccionar las células que han incorporado de manera estable el plásmido en su ADN genómico.

Continúe manteniendo las células utilizando el medio de mantenimiento, y congele periódicamente las líneas celulares para prevenir pérdidas en caso de contaminación inesperada. Para seleccionar líneas celulares clonales, primero trate los cultivos con tripsina y centrifugue las células con medio de mantenimiento según se describe en el protocolo escrito. Luego, resuspenda las células en cinco mililitros de medio de mantenimiento.

Retire 0,5 mililitros de la suspensión celular y agregue 4,5 mililitros de medio de mantenimiento fresco para realizar una dilución 10 x; luego transfiera 100 microlitros de la dilución 10 x a 12 pocillos de una placa de 96 pocillos para seleccionar células individuales. Continúe realizando diluciones seriadas 10 x de estas células aproximadamente 19 veces, hasta obtener una suspensión final teórica de una célula por cada 100 microlitros, y transfiera 100 microlitros de cada dilución seriada a 12 pocillos de una placa de 96 pocillos. Después de 18 horas de incubación, observe las placas de 96 pocillos bajo un microscopio invertido de luz o de fluorescencia y marque los pocillos que parezcan contener solo una célula individual o dos células que obviamente se hayan dividido a partir de una única célula.

Observe las placas todos los días y cambie el medio cada tres días. Deje crecer las células durante una semana hasta alcanzar aproximadamente el 80 % de confluencia. Luego, enjuague los pozos marcados con 200 microlitros de PBS y tripsina.

Incube los ojos con 100 microlitros de solución de PBS tripsina EDTA. Retire la solución de PBS tripsina EDTA. Añada 100 microlitros de medio de mantenimiento y transfiera las células de cada pocillo marcado a un pocillo de una placa de seis pocillos que contenga un mililitro de medio de mantenimiento.

Después de cultivar las células en la placa de seis pocillos durante tres días, transfiera las células a frascos T 25 individuales. Congele periódicamente la línea celular para poder recuperarla si las células dejan de funcionar de manera consistente. Para determinar la línea celular con la mayor respuesta, pruebe las células transferidas mediante el ensayo de bioluminiscencia de calcio con un ligando activo, como el receptor, un péptido, un ligando u otro agonista control positivo.

La prueba de bioluminiscencia de calcio se demostrará en detalle más adelante en este video. Realice la selección de células individuales por segunda vez antes de continuar con el experimento. Cuando se seleccionan líneas celulares clonales para ensayos y se mantienen en cultivo, es fundamental llevar un registro de los números de pasaje, ya que las células con un número elevado de pasajes pueden dejar de funcionar en un matraz T 25.

Líneas celulares en medio de mantenimiento que expresan el receptor deseado hasta alcanzar aproximadamente un 90 % de confluencia. Después de tratar y centrifugar las células en suspensión, resuspenda las células en medio de mantenimiento, diluya las células aproximadamente 10 veces con medio de mantenimiento y cuente el número de células utilizando un hemocitómetro. Ajuste entonces el número de células a aproximadamente dos por diez a la quinta células por mililitro, siembre dos mililitros de las células en cada pocillo de una placa de seis pocillos e incube la placa durante 24 horas, tras lo cual las células deberían alcanzar aproximadamente un 60 % de confluencia antes de comenzar el ensayo de luminiscencia de calcio en placa.

Prepare el gen reportero de interés en el constructo del vector de expresión. Aquí se utiliza un reporte de quórum expresado en mitocondria. Luego, transfecte las células con un microgramo de este plásmido reportero según se describe en el protocolo escrito.

Después de incubar las células en una placa de seis pocillos durante 24 horas, se realiza la tripsinización, centrifugación y resuspensión, se cuenta el número de células hasta alcanzar una concentración de 400.000 células por mililitro y se transfieren 100 microlitros a cada pocillo de una placa microtituladora blanca de 96 pocillos con fondo delgado, incubando durante otras 24 horas hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 80 %. Esta es la concentración óptima de células para el ensayo de bioluminiscencia. Los siguientes pasos deben realizarse en la oscuridad, aunque aquí se muestran a la luz.

Con fines demostrativos, prepare suficiente medio DME sin calcio que contenga cinco micromoles por litro de CHO terezin para 90 microlitros por pocillo. Retire el medio antiguo de la placa y agregue 90 microlitros en cada uno. Incube las placas durante tres horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono, en la oscuridad, tras lo cual las células estarán listas para ser analizadas.

Esta demostración se realiza utilizando un lector de placas Nova star en modo de bioluminiscencia. Para iniciar la purga, la placa que debe ser bombeada por el equipo debe colocarse en el portaplacas mientras está oscuro. Solubilice los péptidos en un tubo EOR de 1,5 mililitros.

Utilice suficiente DME sin calcio y medio para 10 microlitros de péptido 10 x por pocillo. Establezca la profundidad de aspiración y la determinación de posición de la solución de péptido antes de su uso. Desafíe las células con 10 microlitros del péptido e inmediatamente comience a registrar la emisión de luz.

En esta demostración, el instrumento se configura para registrar la emisión de luz a 465 nanómetros para cada pocillo cada dos segundos durante un tiempo total de 50 segundos. Una vez finalizada la corrida, lave las bombas del equipo. Repita el proceso para cada muestra de péptido, guarde los datos y vuelva a lavar las bombas del equipo tras el ensayo.

Los datos de emisión de luz de cada pocillo se transfieren automáticamente a una hoja de datos de Microsoft Excel mediante el programa de software. Pegue los datos desde Excel en Prism Software 4.0. Genere un gráfico con las diversas concentraciones de péptido en el eje x y las unidades de bioluminiscencia.

En el eje Y, seleccione un análisis de ajuste de curva de regresión no lineal para obtener curvas de respuesta de concentración para cada péptido en sus valores correspondientes de CE 50. Cada experimento debe repetirse tres veces para el análisis de datos. Cuando se expresó en ovario de hámster chino, células K uno, el receptor de quinina del mosquito ad's aegypti se comportó como un receptor de múltiples ligandos y respondió funcionalmente a concentraciones tan bajas como un amino.

Para las tres quininas endógenas de Aedes aegypti evaluadas individualmente mediante el ensayo de placa de bioluminiscencia de calcio, se determinaron valores de CE50 estadísticamente diferentes de aproximadamente 16 nanomolares para Aedes aegypti kinina 3, 26 nanomolares para Aedes aegypti kinina 2 y 49 nanomolares para Aedes aegypti kinina 1, lo que resultó en un orden de potencia en el que la kinina 3 de Aedes es la más potente y la kinina 1 de Aedes la menos potente. A continuación se muestra la comparación de la actividad de seis análogos de kinina con ácido alfa-aminoiso-butírico sobre la línea celular de ovario de hámster chino K1 que expresa el receptor de kinina de garrapata, evaluada mediante un ensayo de placa de bioluminiscencia de calcio.

El eje Y representa el porcentaje de unidades máximas de bioluminiscencia para cada análogo, expresado como un porcentaje de la bioluminiscencia observada a una concentración frente a la respuesta máxima observada en todas las concentraciones probadas para cada análogo. El péptido KININE HEXA F-F-F-S-W-G amida es el control positivo para la actividad del receptor. El análogo de kinina con un solo reemplazo, F ácido aminoisobutírico W G amida, fue más activo que el control positivo, el análogo de péptido HEXA KININE; el análogo de kinina con dos reemplazos de ácido aminobutírico, ácido aminobutírico F F ácido aminobutírico W G amida, fue el más potente de los análogos con doble reemplazo probados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar A-G-P-C-R y obtener líneas celulares clonales para analizar las relaciones estructurales de actividad de ligandos sobre receptores mediante un ensayo de bioluminiscencia de calcio.