Técnicas de laboratorio asépticas: Transferencias de volumen con pipetas serológicas y Micropipetas

Esta demostración presenta técnicas de laboratorio asépticas en transferencias de volumen con pipetas serológicas y micropipetas en el banco de laboratorio. Trabaje dentro del campo estéril creado por la llama de un mechero Bunsen. Seleccione el instrumento de transferencia de volumen adecuado para la aplicación.

Luego, utilícelos adecuadamente sin comprometer su esterilidad, manteniendo al mismo tiempo estériles los reactivos y materiales de cultivo, y aspirando líquidos con precisión de forma conjunta. Estos procedimientos son esenciales para minimizar las fuentes de contaminación y garantizar la precisión en experimentos básicos. Inicialmente, resulta difícil ajustar con precisión y leer correctamente los instrumentos, así como coordinar los movimientos con los instrumentos y los materiales de laboratorio sin comprometer la esterilidad de los líquidos que se transfieren.

Practicar una técnica aséptica en el laboratorio es esencial para el éxito experimental al trabajar con especímenes vivos, por lo que es fundamental invertir tiempo en aprender estos procedimientos hasta que se conviertan en una segunda naturaleza. Al trabajar en el banco de laboratorio, el Dr. Chris Reddy, mi coordinador de laboratorio, demostrará los protocolos. Siempre lávese las manos cuidadosamente con jabón antiséptico y agua tibia antes de comenzar cualquier procedimiento de laboratorio. Primero moje las manos con agua corriente tibia.

Luego aplique y distribuya abundantemente jabón con enérgico frotamiento. Frótese las manos generando fricción sobre todas las superficies, incluyendo los pulgares, el dorso de los dedos, el dorso de las manos y debajo de las uñas. A continuación, enjuáguese completamente para eliminar el jabón residual y séquese con toallas de papel dispensadas desde un portarrollos.

Finalmente, con una toalla de papel nueva, cierre el grifo y despeje el área de trabajo de la bancada del laboratorio. Luego, retire una toallita desinfectante prehumedecida del recipiente y limpie toda el área. Deje que el desinfectante se evapore utilizando una luz de encendido.

El mechero Bunsen. Ajuste la llama para que presente un cono azul en el centro. Organice todos los materiales necesarios para el procedimiento cerca del campo estéril de la bancada de laboratorio.

Además, asegúrese de que todos los materiales estén debidamente etiquetados. Existen muchas opciones de pipetas serológicas, de plástico o vidrio, desechables o reutilizables, con punta filtrante o sin ella. Los diferentes tamaños están calibrados con tapones que funcionan como barrera para evitar el llenado excesivo de la pipeta.

Tenga en cuenta que las pipetas serológicas también se calibran de dos maneras. Las pipetas TD marcadas con dobles anillos en la parte superior están calibradas para que el volumen de la punta no se entregue. Esto no se muestra aquí, pero las pipetas TC deben ser sopladas porque están calibradas para entregar todo el volumen utilizando una técnica aséptica con una pipeta serológica de plástico estéril individualmente envuelta, comience por el extremo tapado y comience a retirar cuidadosamente el papel.

No retire toda la funda. Más bien, proteja la punta del mango de la pipeta, solo la parte superior de la pipeta por encima de las marcas de graduación, y coloque un accesorio para pipeta, como una bombilla o pistola, en el extremo superior de la pipeta serológica. Sujete el accesorio para pipeta con una mano y retire la funda de papel de la pipeta de plástico con la otra.

Para pipetas serológicas de vidrio almacenadas en recipientes metálicos, afloje la tapa del recipiente y retire la tapa; flamee los extremos abiertos de la tapa y del recipiente. Luego coloque la tapa de lado sobre la superficie desinfectada del banco. Sostenga el recipiente horizontalmente y agítelo para que las puntas de una o dos pipetas sobresalgan.

Sobresalga aproximadamente una pulgada. Coloque el recipiente horizontalmente y retire una pipeta sin tocar las demás pipetas. Mantenga la punta inferior de la pipeta libre de contacto con las manos y superficies no estériles.

Proceda a colocar el accesorio para pipeta. A continuación, pase el tercio inferior de una pipeta de vidrio a través de la llama del mechero Bunsen durante uno a tres segundos. Ahora retire la tapa del frasco que contiene el medio estéril.

Sujételo entre el dedo anular y la palma de una mano mientras manipula el ayudante de pipeta con el pulgar, el dedo índice y el dedo medio de la misma mano; con la otra mano, sostenga el frasco en un ángulo de 45 grados y pase el borde del frasco a través de la llama del mechero Bunsen. Introduzca la punta estéril de la pipeta en el medio. A continuación, aspire utilizando el ayudante de pipeta para controlar el flujo según las marcas de graduación.

Observe el volumen aspirado en la pipeta para leer con precisión el volumen. Sostenga la pipeta verticalmente y observe el menisco del líquido directamente a nivel de los ojos. Una vez más, pase el borde del frasco a través de la llama del mechero Bunsen.

Luego tápelo. Deje la botella de medio a un lado. A continuación, tome un tubo estéril y de forma aséptica.

Retire el tapón como se describió anteriormente. Cree un campo estéril flameando el borde del tubo. Dispense el medio desde la pipeta dentro del tubo controlando el flujo de la muestra para que no salpique.

Flamee el borde. Nuevamente, coloque la tapa y aparte el tubo. Ahora retire la pipeta, deseche las pipetas de plástico en un recipiente designado para objetos punzocortantes e introduzca las pipetas de vidrio en una solución de lejía al 10%.

Un micropipeteador permite medir y dispensar volúmenes minuciosos con precisión, utilizando instrumentos de diferentes tamaños para rangos de volumen específicos. Tubos y puntas de plástico previamente esterilizados. Utilice también una toallita desinfectante previamente humedecida para limpiar los micropipeteadores. Nota.

El Volter muestra tres números que deben interpretarse en relación con el tipo de micropipeta, con una precisión reflejada en la graduación más pequeña. Marque, por ejemplo, que la P 20 se utiliza para volúmenes entre 2,0 y 20,0 microlitros. El número superior en negro corresponde a las decenas de microlitros.

El segundo número negro indica el volumen en microlitros. El número rojo marca las décimas de microlitro, de modo que cada marca de graduación equivale a un incremento de 0,02 microlitros. Primero, gire el botón de ajuste para establecer el volumen del dispensador según se indica en el volúmetro numérico.

Al disminuir la configuración de volumen en la micropipeta, gire lentamente la rueda del pulgar hasta la marca de graduación. Al aumentar la configuración de volumen, gire hacia arriba pasando la marca de graduación deseada un tercio de vuelta. Luego, gire lentamente hacia abajo la rueda del pulgar para alcanzar el volumen deseado.

Utilice puntas desechables de plástico estériles en todo momento. Coloque una punta firmemente en el extremo del cilindro de la micropipeta. Presione hacia abajo y gire ligeramente para asegurar un sello hermético al aire.

Sostenga el micropipeteador en posición vertical. Observe que el micropipeteador tiene tres posiciones: reposo, primer paro y segundo paro.

Pulse el botón del émbolo desde la posición de reposo hasta el primer tope para desplazar un volumen de aire equivalente al ajustado. A continuación, sumerja la punta en el líquido mientras mantiene pulsado el botón hasta el primer tope. Suelte lentamente el botón para aspirar el líquido dentro de la punta.

Cuando el botón pulsador alcance la posición de reposo, espere un momento para que el líquido sea aspirado hacia la punta. A continuación, retire la punta del líquido. Verifique visualmente la cantidad de líquido aspirado en la punta, asegurándose de que no haya burbujas de aire.

Coloque la punta en un ángulo de 10 a 45 grados contra la pared del tubo que recibirá el líquido. Ahora, presione lentamente el botón del émbolo hasta el primer tope. Expulse el líquido.

Tras un momento, presione el botón pulsador hasta el segundo tope para expulsar cualquier líquido residual. En la punta, proceda a retirar la punta del líquido y luego suelte el émbolo a la posición de reposo. Finalmente, deseche las puntas en el recipiente designado para residuos cortopunzantes presionando el botón de expulsión en la micropipeta.

Primero apague el quemador de la parrilla. Después de guardar todos los materiales y reactivos, pase una toallita desinfectante por las superficies externas del LabWare antes de trasladarlo a su lugar de almacenamiento. Luego, coloque el material de vidrio contaminado y los desechos peligrosos en los recipientes adecuados para su disposición final.

Proceda a limpiar nuevamente toda el área de trabajo, permitiendo que el desinfectante se evapore. Finalmente, lávese las manos cuidadosamente con jabón antiséptico y agua tibia. Sin una técnica aséptica, los cultivos pueden contaminarse y retrasar el experimento.

La transferencia aséptica de líquidos utilizando pipetas serológicas es esencial para amplificar cultivos bacterianos puros, como esta preparación de 25 mililitros de E. coli. Además, las pipetas serológicas facilitan la transferencia aséptica de líquidos a tubos de ensayo estériles. Este ejemplo demuestra un cultivo puro frente a un cultivo contaminado de E. coli en la entrega punto a punto de medio a los tubos.

A veces se requieren volúmenes precisos. Es evidente que en este caso hay una transferencia imprecisa del medio. Este ejemplo muestra un volumen incorrecto de tampón transferido.

En lugar de dispensar 12,5 microlitros, el estudiante dispensó 125 microlitros. Aunque los números se ajustaron de forma idéntica en el volúmetro, se seleccionó el micropipeteador incorrecto para la tarea. Después de ver este video, debería tener un conocimiento práctico sobre cómo aplicar una técnica séptica a procedimientos de laboratorio rutinarios, como la transferencia de soluciones y cultivos utilizando pipetas serológicas y micropipetas, sin comprometer su esterilidad.

El objetivo es que los procedimientos de precaución, como flamear el vidrio, las puntas de pipeta, los tubos de cultivo y los frascos, así como trabajar dentro de los límites de un campo estéril en la bancada del laboratorio, se vuelvan habituales en cada experimento. También es esencial medir y dispensar volúmenes precisos y exactos al realizar experimentos. Aprender a utilizar correctamente estos instrumentos de transferencia de volumen mejorará la fiabilidad de los resultados experimentales.