Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

El objetivo de este procedimiento es realizar imágenes estables in vivo en la médula espinal del ratón utilizando microscopía de dos fotones. Esto se logra primero anestesiando al animal con una mezcla anestésica que logra un ritmo de respiración constante pero tranquilo. El segundo paso del procedimiento es exponer la columna vertebral al nivel deseado y luego realizar una laminectomía para exponer la médula espinal subyacente para que se pueda obtener una imagen in vivo.

El tercer paso es colocar al animal en el dispositivo de estabilización de la columna vertebral. El paso final es el aislamiento del segmento de la médula espinal expuesto. En la preparación para la obtención de imágenes in vivo, en última instancia, se pueden obtener resultados que detallan el comportamiento dinámico de las células y sus interacciones con otros tipos de células o estructuras en la médula espinal viva a través de imágenes in vivo de lapso de tiempo utilizando microscopía de dos fotones.

La principal ventaja de esta técnica sobre los intentos anteriores de obtener imágenes de la médula espinal in vivo es que genera datos de imágenes in vivo que no requieren procesamiento posterior y pueden evaluarse y utilizarse inmediatamente para análisis posteriores. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento tras una lesión o enfermedad medular ya que, por ejemplo, permite estudiar en tiempo real la progresión de la degeneración o regeneración axonal tras una lesión medular además de una lesión medular. Esta técnica se puede utilizar para estudiar la progresión de procesos inflamatorios o neurodegenerativos en modelos animales de enfermedad, como la esclerosis múltiple o la esclerosis lateral amiotrófica, donde la patología de la enfermedad es prominente en la médula espinal.

Comience el procedimiento pesando al animal. A continuación, anestesiar al animal inyectando la mezcla anestésica intraperitoneal. Realice un pellizco regular de los dedos de los pies para asegurar una anestesia profunda del animal durante todo el experimento y complemente con la mitad de la dosis original de anestésico, cada hora o según sea necesario.

A continuación, aplique el ungüento de lágrimas artificiales sobre los ojos para prevenir la deshidratación y el daño de la córnea. Recorta el pelo del lomo del animal con un dispositivo de recorte y afeita el pelo restante con una cuchilla afilada. Después de desinfectar el área afeitada, coloque al animal bajo un microscopio y comience el procedimiento haciendo una pequeña incisión longitudinal de aproximadamente 1,5 centímetros sobre el nivel espinal deseado.

Exponga la musculatura de la espalda retrayendo cuidadosamente el tejido conectivo subcutáneo. A continuación, separe cuidadosamente los músculos paravertebrales de la columna vertebral al nivel deseado. Haga la menor cantidad de incisiones posible para separar los músculos de ambos lados de cada apófisis espinosa.

Después, raspe los músculos desprendidos de la superficie laminada. Use un cauterizador de vasos sanguíneos pequeños para controlar cualquier sangrado menor si es necesario. Continúa raspando los músculos hasta que hayas expuesto lo suficiente el laminado subyacente y puedas identificar claramente el que vas a quitar.

Para preparar los sitios de entrada para las pinzas espinales a cada lado de la columna vertebral, inserte las puntas de un par de tijeras curvas entre los músculos paravertebrales y desplace con cuidado el tejido muscular para crear cuatro bolsillos donde se insertarán las pinzas. Levante la columna vertebral con las pinzas de punta de diente recto para permitir la inserción segura de las tijeras de punta roma curvada debajo de la lámina sin tocar la médula espinal. Luego, realice la laminectomía cortando lentamente el hueso en un lado y luego en el otro lado, use un hisopo de algodón o inserte una pequeña pieza de esponja de gelatina absorbible de espuma de gel precortada junto a la incisión para limitar el sangrado menor.

Después de eso, use el líquido cefalorraquídeo artificial estéril precalentado para lavar el tejido. Se diseñó a medida un dispositivo de estabilización de la columna vertebral con los componentes principales de las pinzas de médula espinal complejas Nagate STSA y el adaptador de sujeción de la cabeza Nagate MA six N. Se fabricó una placa base de acero inoxidable para mantener dos partes de naga alineadas, de modo que la cabeza del animal esté apoyada mientras se sujetan la columna vertebral y la cola.

Tenga en cuenta que todo el dispositivo debe caber debajo de la lente del microscopio en una platina de microscopio bajada para estabilizar al animal. Primero, colóquelo en una almohadilla de elevación en la placa base del dispositivo de estabilización de la columna vertebral. Después de asegurar la cabeza en el adaptador de sujeción de la cabeza, coloque la pinza espinal del dispositivo SDSA a lo largo del eje anteroposterior del animal en los bolsillos preestablecidos, flanqueando la laminectomía.

Coloque las dos pinzas en un ángulo de alrededor de 45 grados en relación con el eje cordal ROS del animal para dejar suficiente espacio para bajar la lente de inmersión en agua sobre la médula espinal expuesta. A continuación, coloque la tercera pinza en la base de la cola para que el cuerpo del animal pueda quedar suspendido después de retirar la almohadilla de elevación en el experimento de imágenes. A continuación, construya un pequeño pocillo de sello de gel alrededor de la médula espinal expuesta para facilitar el mantenimiento de la médula espinal en el líquido cefalorraquídeo A.

A continuación, retire la almohadilla de elevación cuando esté listo para comenzar la obtención de imágenes in vivo, lleve el dispositivo de estabilización a la cámara del microscopio precalentada y colóquelo en la platina del microscopio bajada. Asegúrese de alinear la laminectomía con el cristalino. Baje la lente de inmersión en agua con cuidado en la solución de líquido cefalorraquídeo A y asegúrese de que no toque las pinzas espinales ni el sello de gel.

Utilice la epifluorescencia para identificar el área de interés y concéntrese en ella después. Cambie al modo de escaneo láser y realice imágenes in vivo utilizando los filtros apropiados de excitación láser de dos fotones, longitud de onda, dicroicos y paso de banda para los fluorados presentes en el tejido de la imagen. Al final de los experimentos de imagen, retire al animal del dispositivo de estabilización de la columna vertebral.

Limpie cuidadosamente el sello de gel del área alrededor de la laminectomía y límpielo. Suturar bien los músculos de la espalda sobre la laminectomía. A continuación, suturar la incisión cutánea y frotarla con Betadine que se muestra aquí como una proyección de las imágenes de Zack tal y como se requerían in vivo y posteriormente se proyectaron a lo largo del eje Z sin alineación de la imagen.

La imagen muestra células microgliales positivas para GFP altamente densas en verde, encerradas en proximidad con vasos sanguíneos en rojo en la médula espinal. Aquí hay una imagen de gran aumento de una sola célula microglial unida a la pared de un vaso sanguíneo que muestra en detalle algunos de sus procesos extendidos alrededor del vaso y algunos hacia el parénquima de la médula espinal que se muestra Aquí hay un ejemplo de imágenes repetitivas in vivo de los mismos segmentos axonales marcados con YFP a medida que se reubicaban y se reubicaban en la médula espinal del mismo ratón de línea YFPH en dos sesiones diferentes con cinco días de diferencia. Este es otro ejemplo de imágenes repetitivas que muestran las mismas estructuras vasculares y células microgliales obstruidas in vivo en la médula espinal durante dos días consecutivos.

Aquí hay una secuencia representativa de lapso de tiempo que se adquirió in vivo de la médula espinal. Esta secuencia muestra en detalle el comportamiento dinámico de los procesos más finos de las células microgliales en verde y sus interacciones con la vasculatura en rojo. Con el tiempo, las imágenes en bruto solo se corrigieron para el ruido de fondo, el brillo y el contraste, y la película de lapso de tiempo se construyó rechazando secuencialmente las pilas de imágenes sin alineación de imágenes.

Al promediar la selección australiana de planos individuales, los vasos sanguíneos atraviesan un rango similar de planos Z que las imágenes de la microglía. La profundidad del volumen de la imagen es de 38 micras. Se trata de una secuencia de lapso de tiempo que muestra la estabilidad del método de imagen al nivel de un solo plano Z.

La rápida adquisición del mismo plano Z único en la médula espinal de un ratón heterocigoto CX de tres, CR y GFP anestesiado con la mezcla KXA y colocado en el dispositivo de estabilización de la columna vertebral demuestra un desplazamiento mínimo de la imagen entre fotogramas consecutivos. En particular, la velocidad de esta secuencia fue de un fotograma por segundo, que es más rápida que la frecuencia respiratoria del ratón. El pequeño desplazamiento residual se debe probablemente a los latidos del corazón del animal.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar limitar el número de incisiones al mínimo y tratar de limitar cualquier sangrado menor tan pronto como ocurra. Ahora, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes in vivo estables en el cable de alimentación del mouse utilizando dos fotomicroscopía.