Name: La criopreservación de embriones de preimplantación de ganado, ovejas y cabras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprende la criopreservación de embriones de preimplantación en ganado bovino, ovino y caprino mediante deshidratación celular y almacenamiento en nitrógeno líquido. Este método permite conservar material genético de alta calidad.

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Financiación parcial del proyecto de investigación del USDA en varios estados W-2171 &quot;de células germinales y el desarrollo embrionario y la manipulación para la Mejora de la Ganadería&quot; se agradece. El talento artístico de Ryan Callahan, quien preparó las ilustraciones técnicas para la parte de vídeo de este artículo, también se agradece.

1. Evaluar la idoneidad de embriones para la Criopreservación de un <ol><li> Especímenes capturados en el tracto reproductivo de las hembras donantes individuales deben ser colocados en un medio isotónico embrión explotación durante 10 minutos antes de la evaluación mediante un microscopio estereoscópico. Esté seguro de mantener a los embriones de cada hembra donante separadas unas de otras para permitir la identificación de la paternidad de la descendencia de transferencia de embriones. </li><li> Utilizando magnificación baja (≤ 10 veces), las muestras de una hembra donante deben ser separados en grupos separados que consiste en óvulos no fertilizados, los embriones degenerados o embriones transferibles de calidad. Sólo el grado de calidad 1 o 2 embriones en la mórula compacta a través de etapas de desarrollo de blastocisto expandido son adecuados para la criopreservación, y todos los demás debe ser descartado (a menos que las mujeres sincrónica receptores están disponibles para la calidad de los embriones de grado 3 y una tasa de embarazo después de la transferencia de aproximadamente 25 30% se considera aceptable). </li><li> Inspeccione el grado de calidad 1 y 2 de mórula compacta mediante la ampliación de los embriones en estadio de blastocisto un aumento ≥ 50 veces para asegurarse de que la zona pelúcida del embrión está intacto y que no hay material (por ejemplo, las células, moco) que se adhiere a la zona pelúcida. Cualquier embrión con un roto o falta la zona pelúcida o con una zona pelúcida con material adherente debe estar separados de los otros embriones y, o bien ser desechados o procesados ​​por separado. </li></ol> 2. Los embriones de lavado para reducir la probabilidad de transmisión de la enfermedad 2 <ol><li> Mueva la zona pelúcida intacta embriones en un volumen mínimo de medio embrión isotónica explotación en el primer pocillo de medio de lavado de embriones (por ejemplo, solución salina de fosfato aumenta con antibióticos y suero bovino de albúmina sérica, ternero recién nacido, o alcohol de polivinilo). Mantener los embriones de cada hembra donante por separado, y no trate de lavar más de 10 embriones a la vez. Mueva los embriones en un volumen mínimo de medio en cada lavado sucesivos para alcanzar una serie de dilución ≥ 1:100, y estar seguro de utilizar estéril consejos sobre la manipulación de embriones que se cambian entre cada lavado sucesivos. </li><li> Mueva los embriones a través de 4 lavados más, como se indica en 2.1. </li><li> Si la transmisión de enfermedades virales es motivo de preocupación, lavado de embriones de dos veces en una solución de tripsina 0,25%, para un tiempo total de exposición combinada a la tripsina de no más de 90 segundos. </li><li> Después de los dos se lava la tripsina, lavado de embriones de 5 veces más en el medio de lavado de embriones como se describe en 2.1. </li><li> Después del lavado de embriones final, los embriones en lugar de embriones isotónica la celebración de mediano plazo. </li></ol> 3. Deshidratación embriones antes de la crioconservación 3 <ol><li> Los embriones deben ser transferidos en un volumen mínimo de medio isotónico la celebración de embrión en una solución hipertónica (1.4 a 1.5 Concentración molar) de un agente crioprotector (CPA), tales como etilenglicol o glicerol. </li><li> Permita que los embriones que se siente en medio de congelación (solución hipertónica CPA) hasta alcanzar el equilibrio osmótico. Debido a que el etilenglicol penetra las células embrionarias más rápidamente que el glicerol, tiempos de equilibrio son generalmente menos de embriones en etilenglicol (5 min) que en glicerol (10 min). Parte de este tiempo de equilibrio se puede lograr durante y después de los embriones se cargan en la paja (que se describe en el paso siguiente). </li></ol> 4. Los embriones de carga en una paja de 0,25 ml de plástico para la criopreservación <ol><li> Conecte el extremo tapón de algodón de una pajita de plástico de 0,25 ml (11,5 cm de longitud de trabajo) a un dispositivo de carga de embriones, y aspirar aproximadamente 1,3 cm de solución hipertónica CPA en una paja debidamente etiquetados. Una variedad de procedimientos de etiquetado existe, incluyendo el uso de etiquetas impresas adscribirse a un tapón de paja o de otra paja conectados con un adaptador de paja. </li><li> Retire la paja de la solución de APC, y el aspirado de aproximadamente 0,15 cm de aire para crear una pequeña burbuja de aire dentro de la paja. </li><li> Aspirar un único embrión en alrededor de 0,8 cm de solución hipertónica CPA en la paja. </li><li> Retire la paja de la solución de CPA y el aspirado de aproximadamente 0,15 cm de aire para crear una segunda burbuja de aire diminutos dentro de la paja (burbujas de aire sirven para aislar físicamente el embrión dentro de la paja). </li><li> Aspirar aproximadamente 9,1 cm de la solución de APC para llenar completamente la paja, con la certeza de atraer un volumen suficiente de solución de APC para humedecer el cloruro de polivinilo (PVC) en polvo que existe en el extremo del enchufe de algodón de la paja. La solución CPA causa el polvo de PVC con gel y sellar el extremo de la paja. </li><li> Sellar el otro extremo de la paja con el polvo de PVC, plástico tapones de paja, o un cierre por calor. </li></ol> 5. La colocación de los embriones en una máquina de congelación de embriones velocidad controlada <ol><li> Cualquiera de baño de metanol o congelación con nitrógeno líquido con máquinas de vapor puede ser programado para la crioconservación de embriones de preimplantación. </li><li> La carga de la paja que contiene la Embry<html> os en una máquina de congelación, cuya temperatura se ha enfriado desde la temperatura ambiente hasta los -6 º C. Pajas de carga final de algodón tapar (a no ser de plástico tapones paja o adaptadores de paja se están utilizando, en la que el algodón caso extremo del enchufe se coloca hacia abajo). </li><li> Permita que los embriones que se siente a esta temperatura durante al menos 2 minutos antes de proceder. </li></ol> 6. Siembra <ol><li> Una vez que los embriones se hayan enfriado a -6 ° C, utilice un par de pinzas de súper en nitrógeno líquido (o un palo con punta de algodón sumergida en nitrógeno líquido) para inducir la formación de cristales de hielo en la solución de CPA dentro de la paja al tocar las pinzas (o algodón palo con punta) en la columna de la solución por encima o por debajo del embrión. </li><li> El agua en la solución de APC se cristaliza en la región expuestos a nitrógeno líquido, y cristales de hielo se extienda a la columna de la solución de APC de inmediato que rodea al embrión. </li><li> Mantener los embriones en la siembra de temperatura durante 10 minutos antes de enfriamiento. </li></ol> 7. La deshidratación continua de embriones <ol><li> Embriones frescos a una tasa de 0,5 ° C / min hasta una temperatura de -34 ° C. Esta velocidad de enfriamiento es importante asegurarse de deshidratación continua del embrión. </li><li> Mantener embriones a -34 ° C durante 10 minutos, antes de caer a los embriones en nitrógeno líquido (-196 ° C). </li><li> Lugar criopreservado embriones en una copa debidamente etiquetados (lleno de nitrógeno líquido) unido a una caña debidamente etiquetados, y colocar el bastón en un recipiente de un termo de nitrógeno líquido para su almacenamiento a corto o largo plazo. </li></ol> 8. Descongelar embriones criopreservados <ol><li> Tire de la lata en el cuello del termo de nitrógeno líquido, asegurando que el recipiente se mantiene por debajo de la línea de hielo en el termo. </li><li> Localice la caña que contiene el embrión para ser descongelados, y rápidamente y retire con cuidado la paja de la copa, tener la certeza de que no se caliente otras pajas en la copa. </li><li> Sujete la paja en el aire durante 3-5 segundos (para reducir la incidencia de un agrietado zona pelúcida 4), ​​y luego se sumergen en un baño de agua 37 ° C por un período adicional 25-30 segundos. </li><li> Quitar la paja del baño de agua, limpie la paja (con cuidado de no ensuciar la identificación de embriones en la paja), utilizar un dispositivo de corte de la paja para cortar el extremo del enchufe no sean de algodón de la paja (si es sellado con calor o con polvo de PVC ), o retirar con cuidado el tapón de cierre de plástico, y ya sea: <ol type="a"><li> carga de la paja en un dispositivo de transferencia de embriones y la transferencia lo antes posible a un destinatario embrión sincrónica (pero sólo si el embrión fue criopreservado con etilenglicol como la CPA), o </li><li> Mantenga la parte de la paja sobre un plato que contiene una concentración de 1,0 molar de sacarosa (un compuesto no penetra), y el uso de un par de tijeras para cortar el extremo del enchufe de algodón de la paja. Contenido de la paja debe fluir libremente en la solución de sacarosa, sino a impulsar una pequeña columna de aire a través de la paja puede ser necesaria si ningún medio residual existe dentro de la paja. Permita que los embriones a permanecer en una solución de sacarosa durante 10 minutos, y luego se transfieren los embriones a embriones isotónica la celebración de medio durante 10 minutos. Evaluar embriones post-descongelación, la carga de paja en una nueva, y la transferencia a hembras receptoras adecuadas. </li></ol></li></ol> 9. Los resultados representativos: Una variedad de factores pueden influir en el embarazo y tasas de nacidos vivos como resultado de la transferencia de embriones de preimplantación congelados a hembras receptoras sincrónica 5. Los embriones en etapas de desarrollo menos avanzado que el de mórula compacta o avanzado más de blastocisto expandido a menudo no sobreviven el proceso de criopreservación de embriones, así como en la mórula compacta y blastocisto temprano, blastocisto, y amplió las etapas del desarrollo embrionario de blastocisto. Embriones de calidad de grado 1 y 2 de mayor rendimiento deshielo post-las tasas de embarazo que la calidad de los embriones de grado 3 (que por lo general no son criopreservados, debido a la baja las tasas de embarazo después de la descongelación). Embriones mal manejo durante la congelación de embriones o el embrión descongelado procedimientos son propensos a exhibir tasas de reducción de embarazo. Embriones transferidos a hembras receptoras cuyos ciclos del estro no se han sincronizado con el de la hembra donante normalmente producen menores tasas de embarazos. Embriones producidos in vitro o manipulados de alguna forma (por ejemplo, una biopsia o dividida en dos) por lo general menor rendimiento tasas de embarazo. Bajo condiciones óptimas, las tasas de embarazo obtenidas luego de la transferencia de los congelados los embriones es típicamente un 60-70% en el ganado 6,7, 65-75% en el ganado ovino 8,9,10,11 y 60 a 70% en el ganado caprino 12,13,14,15. Del mismo modo, las tasas de embarazo obtenidas luego de la transferencia de los congelados embriones producidos in vitro suele ser un 40-50% en el ganado 6,16, 25-35% en el ganado ovino 17, y 30-40% en las cabras de 18 años. tabla 1 &quot;/&gt; Tabla 1. Esperado las tasas de embarazo después de la transferencia de embriones congelados de animales domésticos de las especies de rumiantes ganado a hembras receptoras sincrónica.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Porque los embriones son, sobre todo de agua, es fundamental que los embriones de preimplantación adecuadamente deshidratado y se enfrió lentamente, de acuerdo con el protocolo descrito en este documento para evitar la formación de cristales de hielo intracelular. Una vez que el proceso de enfriamiento ha comenzado, es importante para mantener los cambios de temperatura y unidireccional para evitar las fluctuaciones de temperatura. Inicio de la formación de cristales de hielo (&quot;siembra&quot;) a una temperatura adecuada para la solución específica del CPA es fundamental. Las modificaciones a este enfriamiento lento / método rápido deshielo de la criopreservación de embriones de preimplantación incluyen el método de un solo paso (en la última columna del medio de carga en la paja es la sacarosa en lugar de solución CPA) 19 y el método de transferencia directa (cuando los embriones congelados en etilenglicol se descongelan y se transfieren directamente al útero de una hembra receptora sin quitar primero el glicol de etileno a partir del embrión) 20. Para reducir el volumen de etilenglicol depositado en el útero de una transferencia directa (DT) mujeres destinatario, es recomendable llenar la paja de 0,25 ml con 6 cm de la celebración de medio antes de continuar como se describió anteriormente. Cabe señalar que existe una norma voluntaria dentro de la industria de transferencia de embriones comercial que preimplantación de embriones criopreservados para su DT deben ser congelados de color amarillo paja y se almacena en copas de color amarillo en el termo de nitrógeno líquido. El sector comercial también tiene requisitos específicos de etiquetado para todos los embriones congelados que se deben seguir. Una alternativa a este método es la vitrificación de 21 años, el método de no equilibrio de criopreservación, donde se enfría una mayor concentración (6.8 M) CPA solución ultra-rápidamente causando la solución APC para cambiar de estado líquido a una &quot;vidriosa&quot; estado sin hielo la formación de cristales. La vitrificación es probablemente más adecuado para la crioconservación de embriones que son menos avanzados que el desarrollo de mórula compacta debido a su sensibilidad a la temperatura aumenta. Esta técnica tiene una aplicación para la conservación de los recursos de germoplasma 22, así como a los internacionales de la industria comercial de la transferencia de embriones, donde más del 55% de los aproximadamente 500.000 preimplantación de embriones de bovino transferidos en el año calendario 2008 fueron criopreservados. 23

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> BioLife medio de congelamiento </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C18A C18, </td><td> 1,5 M etilenglicol </td></tr><tr><td> Emcare etilenglicol congelación de la solución </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1,5 M etilenglicol </td></tr><tr><td> Etileno glicol Vigro freeze plus </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM835 </td><td> 1,5 M etilenglicol </td></tr><tr><td> Emcare 10% de glicerol solución de congelación </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC12 </td><td> 1,34 M de glicerol </td></tr><tr><td> Emcare 1 M sacarosa deshielo </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC16 </td><td> 1,0 M sacarosa </td></tr><tr><td> Vigro un paso deshielo </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> 1,0 M sacarosa </td></tr><tr><td> Vigro deshielo 1-2-3 más </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5%, 2,5%, 0% de glicerol con 0,5, 0,5, 0,6% de sacarosa </td></tr><tr><td> Emcare CSU descongelación kit </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3%, 0% de glicerol con un 10,3% de sacarosa </td></tr><tr><td> BioLife tenencia y medio de transferencia </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C15, C15A </td><td> modificado PBS con 0,4% de BSA (albúmina de suero bovino) </td></tr><tr><td> Emcare la celebración de una solución </td><td> ICPBio reproducción </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0,4% de BSA (albúmina de suero bovino), MOPS buffer (zwitteriones inerte) </td></tr><tr><td> Vigro la celebración de más </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> Sosteniendo SYNGRO medio </td><td> Bioniche Sanidad Animal </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> contiene ácido hialurónico, sin productos de origen animal </td></tr><tr><td> BioLife modificado D-PBS </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C06 </td><td> fosfato de Dulbecco modificado solución salina tamponada </td></tr><tr><td> BioLife BSA fracción V </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B09 </td><td> albúmina de suero bovino liofilizado, fracción V </td></tr><tr><td> BioLife antibiótico-antimicótico </td><td> Agtech, Inc. </td><td> B01 </td><td> anfotericina B, penicilina G, sulfato de estreptomicina </td></tr><tr><td> BioLife tripsina kit </td><td> Agtech, Inc. </td><td> C22A </td><td> 25 g de tripsina liofilizada, agua estéril, estéril D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Biol-Cool congelador velocidad controlada </td><td> FTS Sistemas </td><td> BC-IV -40 </td><td> Metanol congelador baño </td></tr><tr><td> Congelar el congelador de control velocidad controlada </td><td> Criológico </td><td> CL2200 </td><td> Congelador de nitrógeno líquido </td></tr></tbody></table>

la criopreservación de embriones de preimplantación de ganado, ovejas y cabras

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantación de embriones de ganado vacuno, ovejas y cabras pueden ser criopreservados para su almacenamiento a corto o largo plazo. Preimplantación de embriones consisten principalmente en agua, y evitar la formación intracelular de cristales de hielo durante el proceso de criopreservación es de suma importancia para mantener la viabilidad del embrión. Los embriones son colocados en una solución hipertónica (1,4 a 1,5 M) de un agente crioprotector (CPA) como el etilenglicol (EG) o glicerol (GLI) para crear un gradiente osmótico que facilita la deshidratación celular. Después de embriones alcanzar el equilibrio osmótico en la solución de APC, son individualmente cargado en la solución hipertónica CPA en pajuelas de 0,25 ml de plástico para congelar. Los embriones son colocados en un congelador velocidad controlada a una temperatura de -6 ° C. La formación de cristales de hielo se induce en la solución de CPA que rodea el embrión, y la cristalización provoca un aumento en la concentración de la CPA fuera del embrión, provocando una mayor deshidratación celular. Los embriones se enfría a una velocidad de 0,5 ° C / min, lo que permite una mayor deshidratación, a una temperatura de -34 ° C antes de ser sumergido en nitrógeno líquido (-196 ° C). Embriones congelados deben descongelarse antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Pajillas que contienen los embriones se retiran de la termo de nitrógeno líquido, que se celebró en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 segundos, y se coloca en un baño de agua 37 ° C durante 25 a 30 segundos. Embriones criopreservados en GLI se colocan en una solución 1 M de sacarosa durante 10 minutos para la eliminación de la CPA antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Embriones congelados en EG, sin embargo, pueden ser directamente transferidos al útero de un destinatario.

Preimplantación de embriones criopreservados pueden ser después de la colocación en una solución hipertónica de crioprotectores a causa deshidratación celular. Después de equilibrio, la formación de cristales de hielo se induce en la solución que rodea al embrión. Una mayor deshidratación se produce cuando el embrión se enfría lentamente a temperaturas bajo cero antes de sumergirse en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

La criopreservación de embriones de preimplantación de ganado, ovejas y cabras

Los embriones preimplantacionales de bovinos, ovinos y caprinos pueden criopreservarse para su almacenamiento a corto o largo plazo. Los embriones preimplantacionales consisten predominantemente...

El objetivo general de este procedimiento es criopreservar con éxito embriones en etapa preimplantacional de ganado bovino, ovino y caprino. Esto se logra primero examinando especímenes recuperados de la hembra donante para identificar aquellos que son adecuados para la criopreservación. Calidad. Los embriones de grado uno y dos son adecuados para la criopreservación.Sin embargo, los embriones no fertilizados, los embriones degenerados y los embriones de calidad grado tres no son adecuados para la congelación, al igual que aquellos menos desarrollados que un módulo compacto o que ya han iniciado o completado el proceso de eclosión. Tampoco son adecuados para la congelación los embriones en proceso de eclosión. El segundo paso del procedimiento consiste en deshidratar sustancialmente el embrión colocándolo en una solución hipertónica de un agente crioprotector, como el etilenglicol.Se muestra aquí un embrión colocado en un medio de sostenimiento isotónico, donde los puntos azules representan moléculas de agua para iniciar el proceso de deshidratación. El embrión se coloca en la solución hipertónica de etilenglicol, una molécula representada por puntos rojos. A medida que el embrión permanece en la solución de etilenglicol, ocurren varios cambios en el embrión.El agua sale rápidamente de las células del embrión, lo que provoca que el embrión disminuya su tamaño. Concurrentemente, el etilenglicol entra en las células del embrión, haciendo que este aumente de tamaño hasta que finalmente alcanza el equilibrio osmótico. El tercer paso del procedimiento consiste en inducir la formación de cristales de hielo en la solución que rodea al embrión.Un procedimiento conocido como siembra permite una mayor deshidratación del embrión mientras se enfría lentamente al tocar los laterales de la pajilla que contiene el embrión. Con pinzas metálicas sobreenfriadas y cristales de hielo de nitrógeno líquido, comenzarán a formarse cristales de hielo en la solución que rodea al embrión. Los cristales de hielo continúan extendiéndose a través de la solución hasta que la cristalización se completa.El último paso del procedimiento de congelación consiste en sumergir el embrión en nitrógeno líquido para su almacenamiento a corto o largo plazo a menos 196 grados Celsius. En última instancia, se pueden obtener resultados que indiquen que la deshidratación adecuada del embrión antes y durante el procedimiento de criopreservación puede conducir a la producción de descendencia viable tras la transferencia de embriones adecuadamente T pensados a una hembra receptora sincronizada. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a los retos para discernir qué especímenes son adecuados para la criopreservación.Para cargar adecuadamente los embriones en las pajuelas de 0,25 ml para congelación, así como para evitar errores involuntarios en el manejo de los embriones durante los procedimientos de congelación y descongelación, se deben recolectar especímenes del tracto reproductivo. Primero se debe evaluar individualmente a cada hembra donante bajo un microscopio estereoscópico para determinar su idoneidad para la criopreservación. Coloque los embriones en un medio de mantenimiento isotónico para embriones durante 10 minutos antes de la evaluación.Asegúrese de mantener separados los embriones de cada hembra donante para permitir la identificación de la filiación de la descendencia obtenida mediante transferencia embrionaria, utilizando baja magnificación para separar los especímenes procedentes de una hembra donante individual en grupos distintos que consistan en óvulos no fertilizados para generar embriones o embriones de calidad transferible. Los embriones se clasifican según una serie de factores descritos previamente por Lindner y Wright, con el fin de determinar si presentan calidad transferible o no. Solo los embriones en estadio de mórula compacta hasta blastocisto expandido, con una calidad de grado uno o dos, son adecuados para criopreservación.Los embriones de grado tres, aunque no son adecuados para la criopreservación, pueden transferirse a una hembra receptora y producir una tasa de embarazo tan alta como del 25 al 30%. Todos los embriones degenerados y los óvulos no fertilizados deben descartarse; los embriones menos avanzados en desarrollo que un estadio de morula compacta deben mantenerse en cultivo o descartarse. Examine los embriones de grado uno y dos con un aumento igual o mayor a 50 x para asegurarse de que la zona pelúcida del embrión esté intacta y de que no haya material adherido a la zona pelúcida.Cualquier embrión con una zoma palita agrietada o ausente, o con una zoma palita que tenga material adherido, debe separarse de los demás embriones y procesarse por separado. Después de evaluar los embriones seleccionados para verificar la presencia de un zop lucita intacto, se lavan para reducir la probabilidad de transmisión de enfermedades. Mantenga separados los embriones de cada donante hembra y no intente lavar más de 10 embriones al mismo tiempo.Para lavar los embriones, transfiéralos en cinco microlitros de medio isotónico de mantenimiento de embriones a 500 microlitros de medio de lavado de embriones. En el primer pocillo de una placa de seis pocillos, agite los embriones en el pocillo para diluir cualquier patógeno potencial que pudiera estar presente.Cambie la punta estéril para manipular embriones antes de trasladar los embriones a un nuevo pocillo para el siguiente paso de lavado. Luego, transfiera los embriones al segundo pocillo, asegurando una dilución de uno a 100 con medio de lavado fresco para embriones, como en el primer lavado.Agite los embriones en el pocillo. Pase los embriones por un total de cinco lavados utilizando una dilución de al menos uno a 100 en cada lavado sucesivo y cambiando las puntas estériles para manipulación de embriones entre cada lavado. Lave los embriones dos veces en solución de tryin al 0,25 % durante no más de 90 segundos en total antes del conjunto final de cinco lavados en medio de lavado de embriones.Una vez finalizado el lavado, coloque los embriones en un medio de mantenimiento isotónico para embriones antes de la criopreservación. Deshidrate los embriones transfiriéndolos, en un volumen mínimo de medio de mantenimiento isotónico para embriones, a una solución hipertónica de un agente crioprotector, como el etilenglicol. Después de que los embriones hayan completado la deshidratación inicial, deben cargarse en pajuelas de 0,25 ml para su congelación.Dado que esta es la parte más exigente técnicamente del procedimiento, es importante que los técnicos practiquen la carga de las pajillas utilizando únicamente medio, y no embriones, hasta que adquieran destreza. Con esta técnica, la ubicación del embrión dentro de la pajilla, así como el tamaño y la posición de las burbujas de aire, son cruciales para una criopreservación embrionaria exitosa. Para comenzar a cargar un embrión en una pajilla plástica de 0,25 mililitros para criopreservación, conecte el tapón de algodón de una pajilla debidamente etiquetada a un dispositivo de carga embrionaria, que en esta demostración consiste en un catéter tomcat acortado unido a una jeringa de un cc completamente plástica; aspire aproximadamente 0,05 mililitros de solución hipertónica de CPA a la pajilla.Retire el pajilla de la solución de CPA y aspire un pequeño volumen de aire para crear una pequeña burbuja de aire dentro de la pajilla. A continuación, aspire un solo embrión rodeado por aproximadamente 0,025 mililitros de solución hipertónica de CPA dentro de la pajilla. Retire la pajilla de la solución de CPA y aspire un pequeño volumen de aire para crear una segunda pequeña burbuja de aire dentro de la pajilla.Las dos burbujas de aire sirven para aislar físicamente el embrión dentro de la pajilla y aspirar la solución de CPA para llenar completamente la pajilla con certeza. Se debe aspirar un volumen suficiente de solución de CPA para humedecer el polvo de cloruro de polivinilo existente en el extremo de la pajilla tapado con algodón. La solución de CPA hará que el polvo de PVC se gelifique y selle ese extremo de la pajilla.Finalmente, selle el otro extremo del popote con el sellador térmico. La máquina de congelación de velocidad controlada utilizada aquí para la criopreservación de embriones en etapa preimplantacional es una máquina de congelación por vapor de nitrógeno líquido cuya temperatura se ha enfriado desde la temperatura ambiente hasta menos seis grados Celsius. Para comenzar este procedimiento, cargue los popotes que contienen los embriones, con el tapón de algodón hacia arriba, en la máquina de congelación.Deje que los embriones reposen a esta temperatura durante al menos dos minutos antes de proceder a la siembra. Una vez que los embriones hayan alcanzado menos seis grados Celsius, utilice un par de pinzas, enfriadas previamente y sumergidas en nitrógeno líquido, para inducir la formación de cristales de hielo en la solución de CPA dentro de la pajilla tocando con las pinzas la columna de solución, ya sea por encima o por debajo del embrión. Dado que los embriones no deben permanecer fuera de la máquina de congelación más tiempo del necesario, con fines demostrativos en este video, utilizaremos una pajilla sin embrión para mostrar lo que ocurre dentro de la pajilla durante la siembra.Cuando las pinzas sobreenfriadas tocan la región del popote que contiene la solución de CPA, el agua en la solución de CPA cristalizará en la zona expuesta a las bajas temperaturas provocadas por las pinzas enfriadas con nitrógeno líquido, y los cristales de hielo se extenderán hacia la columna de solución de CPA que rodea inmediatamente al embrión. Después de 10 minutos a seis grados bajo cero, enfríe los embriones a una velocidad de 0,5 grados Celsius por minuto, hasta alcanzar una temperatura de menos 34 grados Celsius. Mantenga los embriones a menos 34 grados Celsius durante 10 minutos. Finalmente, coloque los embriones criopreservados en un vial adecuadamente etiquetado lleno de nitrógeno líquido sujeto a una varilla adecuadamente etiquetada, y coloque la varilla en un recipiente de un tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a corto o largo plazo a menos 196 grados Celsius, listos para descongelar los embriones criopreservados.Primero, introduzca el recipiente en el cuello del tanque de nitrógeno líquido D uar, asegurándose de que el recipiente permanezca por debajo de la línea de escarcha. En el doer, localice la varilla que contiene el embrión que se va a descongelar y retire rápidamente y con cuidado la pajilla del vaso. Tenga cuidado de no calentar otras pajillas dentro del vaso.Sostenga la pajilla en el aire durante tres a cinco segundos para reducir la incidencia de grietas en la Z de lucita, y luego sumerja la pajilla en un baño de agua a 37 grados Celsius. Durante un período adicional de 25 a 30 segundos, retire la pajilla del baño de agua y séquela con cuidado de no borrar la identificación del embrión en la pajilla. A continuación, utilice un dispositivo cortapajillas para cortar el extremo de la pajilla que no tiene el tapón cónico.Aunque los embriones criopreservados con etilenglicol pueden transferirse directamente al útero de una hembra receptora sincronizada inmediatamente después de la descongelación, los técnicos que deseen realizar una evaluación visual posterior a la descongelación antes de la transferencia deben eliminar primero el etilenglicol del embrión. Para lograrlo, coloque el extremo abierto de la pajilla sobre un recipiente que contenga una solución de sacarosa a una concentración de un molar del compuesto no permeante, y corte con un par de tijeras el extremo de la pajilla que contiene el tapón de algodón. El contenido de la pajilla debería fluir libremente hacia la solución de sacarosa, aunque puede ser necesario empujar una pequeña columna de aire a través de la pajilla.Si queda medio residual dentro de la pajilla, deje los embriones en la solución de sacarosa durante 10 minutos y luego transfiera los embriones al medio de mantenimiento isotónico para embriones durante 10 minutos. Después de 10 minutos en medio de mantenimiento isotónico para embriones, se pueden evaluar los embriones bajo el microscopio. Esta tabla muestra la tasa de embarazo esperada tras la transferencia de embriones congelados de especies domésticas de rumiantes.Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo criopreservar embriones en etapa preimplantacional de ganado bovino, ovino y caprino. Este procedimiento puede ser un valioso complemento al conjunto de habilidades de su laboratorio y puede resultar muy útil para preservar líneas genéticas únicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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