Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti
16 de mayo de 2011
Un método simplificado pero preciso para recoger y mancha hemocitos mosquito se describe. Nuestro método combina la simplicidad de la perfusión con la precisión de las técnicas de inyección de alta para aislar a los preparativos limpia de hemocitos en los mosquitos Aedes. Este método facilita el conocimiento de los estudios que requieren los tipos de hemocitos y su abundancia.
El objetivo general de este procedimiento es recolectar y teñir los hemocitos de mosquitos. Esto se logra primero inyectando un pequeño volumen de diluyente anticoagulante en mosquitos enfriados. Para soltar los hemocitos y obtener todos los hemocitos en solución.
El segundo paso del procedimiento consiste en eliminar las patas, las alas y la punta del abdomen del mosquito. En tercer lugar, se inyecta diluyente fresco en un sitio separado del mosquito para iniciar el proceso de perfusión. El paso final es dirigir la hemo-linfra diluida hacia un portaobjetos preparado para que los hemocitos recolectados puedan fijarse y teñirse.
En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los principales tipos y número de hemocitos presentes en la especie de mosquito de interés mediante microscopía básica de frotis. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la profusión es que combina la simplicidad de la profusión con la precisión obtenida mediante métodos de alta inyección, pero con menos pasos hacia el objetivo final. Nuestro objetivo es identificar los tipos de hemocitos y su abundancia en respuesta a desafíos inmunitarios.
Quien demuestra esta técnica es Amina Abdul Kum, una estudiante universitaria de mi laboratorio. Antes de comenzar el protocolo, prepare la solución diluyente de hemolinfa en alícuotas de un mililitro. Almacénelas a menos 20 grados Celsius y no vuelva a congelar ninguna porción no utilizada de una alícuota.
Ahora, en portaobjetos de microscopio de un milímetro de grosor, marque círculos de un centímetro. Se necesita un portaobjetos por mosquito. Prepare agujas estiradas.
Rompa la punta de cada aguja estirada para crear una abertura en la aguja. Ensamble una aguja en su soporte, que está unido a los componentes de tubo y jeringa de un microinyector. A continuación, elimine las burbujas de aire del ensamblaje del tubo y el soporte de la aguja utilizando aceite mineral.
Usted aspira aceite mineral en esta jeringa manual y se asegura de no obtener burbujas. Coloca algo debajo de la aguja para recoger el aceite que gotee. Abre esta parte del microinyector y luego introduce aceite aquí para eliminar cualquier burbuja.
Y esto simplemente se acopla a esta jeringa manual, tal como lo hace con la otra punta. Inyecte lentamente el aceite mineral para que atraviese el tubo plástico y elimine cualquier burbuja presente. Luego, nuevamente, rellene en exceso la parte superior con aceite mineral hasta el punto en que comience a gotear.
Luego, desea volver a conectar esto a esta jeringa de vidrio para no obtener burbujas. A continuación, rellene con aceite mineral los componentes ensamblados hasta que todo el tubo de la aguja y la jeringa estén llenos. El microinyector ya está listo para usarse en la entrega del diluyente.
A continuación, prepare los animales aspirando 15 hembras adultas hacia un recipiente pequeño y sólido que se sumergirá completamente en hielo. Los mosquitos quedan anestesiados cuando quedan inmovilizados por el frío, lo cual generalmente toma ocho minutos o menos. Coloque un mosquito anestesiado individual sobre una laminilla con cavidad donde se llevará a cabo la microinyección.
Al microscopio, aspire 12 microlitros de diluyente de hemolinfa al microinyector. Sujete suavemente el mosquito bajo el microscopio con pinzas e inyecte de tres a 3,5 microlitros del diluyente. Entre el séptimo y el octavo segmento abdominal, el abdomen se hinchará.
Mientras se inyecta el diluyente, se pueden inyectar tres mosquitos. Antes de recargar el microinyector, coloque todos los mosquitos inyectados en un vaso plástico limpio sobre hielo, donde los mosquitos se recuperarán durante aproximadamente cinco minutos. Durante la incubación, el diluyente anticoagulante desaloja los hemocitos adheridos a los tejidos internos.
Mientras el primer lote de animales se recupera durante la incubación, por lo general se pueden inyectar otros tres a cinco mosquitos. Después de los cinco minutos, mientras aún están en el vaso, prepare los mosquitos inyectados cortándoles las patas, alas y las puntas de sus abdomens en el octavo segmento con tijeras microscópicas. Tenga cuidado de no cortar las patas y alas demasiado cerca del tórax o de la hemo.
Puede que Limp escape. Ahora lave un portaobjetos grabado con etanol al 70% y séquelo con una toallita Kim bajo el microscopio. Coloque un mosquito diseccionado en el borde exterior del círculo grabado.
Cargue el microinyector con 12 microlitros de diluyente fresco. Sujete el mosquito con pinzas e inyecte de ocho a diez microlitros en el lado lateral del mesotórax. Tenga cuidado de no inyectar aceite mineral después de esta inyección.
El hemo linfático se acumulará desde el abdomen hacia el círculo grabado; presione suavemente el abdomen con pinzas para dirigir e incentivar el flujo del hemo linfático. Ahora permita que el hemo linfático recolectado se seque sobre el portaobjetos. Esto debería tomar aproximadamente 10 minutos.
Luego está listo para ser teñido. Tiña cada portaobjetos por separado con Hema tres. Sumerja cada portaobjetos en el fijador cinco veces durante solo un segundo por inmersión.
A continuación, realice tres inmersiones de un segundo en la solución uno y luego en la solución dos. Enjuague solo la parte posterior del portaobjetos con agua desionizada, no la parte frontal. Seque el lado frontal, coloque un cubreobjetos con medio de montaje y presione suavemente el cubreobjetos para que el medio se extienda completamente sobre el tejido teñido.
Ahora, deje secar la preparación durante un mínimo de tres horas para obtener resultados óptimos. Las células teñidas deben visualizarse e imagenarse dentro de las dos semanas siguientes a esta preparación. Estas células de hembras adultas se identificaron utilizando este protocolo.
La primera imagen muestra un sitio hemopoyético pro eritroblástico basado en su forma ovalada y en la alta relación núcleo-citoplasma. Esta imagen corresponde a un citoplasma de eritrocito nucleado (ENO) basado en su forma ovalada y en la relación citoplasma-núcleo. Por último, este es un sitio hemopoyético de tipo granulocítico.
Tiene una textura más granular y es más OID en forma en comparación con los métodos anteriores de alta inyección. Este protocolo produjo un número total similar de hecitos e identificó asimismo los sitios granulares como el tipo celular más común una vez dominado. Esta técnica puede realizarse en una hora para aproximadamente 15 a 20 mosquitos si se realiza adecuadamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar adecuadamente mosquitos con dent, cómo recolectar sus hemolinfas y luego cómo preparar las hemolinfas para su visualización e imagenología.
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Descripción general
Este artículo describe un método simplificado pero preciso para recolectar y teñir hemocitos de mosquitos. La técnica combina la perfusión con métodos de inyección alta para aislar preparaciones limpias de hemocitos en mosquitos del género Aedes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Entomología
- Biología celular
Antecedentes
- Los hemocitos desempeñan un papel crucial en la respuesta inmunitaria de los mosquitos.
- Comprender los tipos y la abundancia de hemocitos es esencial para diversos estudios biológicos.
- Los métodos actuales para la recolección de hemocitos pueden ser complejos y consumir mucho tiempo.
- Este estudio tiene como objetivo simplificar el proceso manteniendo la precisión.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la recolección eficiente de hemocitos de mosquitos.
- Facilitar estudios sobre los tipos de hemocitos y su abundancia.
- Mejorar la precisión de las técnicas de aislamiento de hemocitos.
Métodos Utilizados
- Inyección del diluyente anticoagulante en mosquitos enfriados.
- Eliminación de patas, alas y punta del abdomen para acceder a la hemolinfa.
- Inicio del proceso de perfusión mediante la inyección de diluyente fresco.
- Recolección de la hemolinfa sobre un portaobjetos preparado para su tinción.
Resultados principales
- El método aísla con éxito preparaciones puras de hemocitos.
- Alta precisión al identificar los diferentes tipos de hemocitos.
- Facilita investigaciones futuras sobre la inmunología de los mosquitos.
- El proceso optimizado reduce el tiempo y la complejidad de la recolección de hemocitos.
Conclusiones
- El método descrito es eficaz para estudiar los hemocitos de mosquitos.
- Combina simplicidad y precisión, lo que lo hace accesible para los investigadores.
- Esta técnica puede mejorar nuestra comprensión de la biología e inmunología de los mosquitos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La recolección y tinción confiable de hemocitos de mosquito es fundamental para validar la función de las células inmunitarias en la biología de vectores, afectando directamente la validación inicial de dianas para intervenciones contra enfermedades transmitidas por vectores. Este protocolo permite el aislamiento estandarizado y reproducible de hemocitos de Aedes aegypti, favoreciendo la reducción de riesgos mecanicistas y una mayor confianza predictiva en estudios sobre inmunidad innata de mosquitos. Flujos de trabajo optimizados para el análisis de células inmunitarias facilitan la toma de decisiones en el desarrollo de estrategias de control de vectores y en la creación de mosquitos transgénicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis de poblaciones de células inmunitarias de mosquitos para la validación funcional de objetivos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar la abundancia de hemocitos y su respuesta a desafíos inmunitarios.
- Proporciona datos celulares cuantitativos para informar la confianza predictiva en estudios de biología de vectores.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona preparaciones estandarizadas de hemocitos para ensayos inmunológicos posteriores.
- Mejora la reproducibilidad y precisión en los flujos de trabajo de identificación y cuantificación celular.
- Facilita la preparación de ensayos para evaluar intervenciones anti-patógenos en mosquitos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los resultados inmunitarios celulares con modelos de vectores relevantes para la enfermedad.
- Permite la continuidad desde el perfilado inmunitario en fase de descubrimiento hasta la validación preclínica de estrategias de control de vectores.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de enfoques transgénicos o inmuno-moduladores en mosquitos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica en la investigación de enfermedades transmitidas por vectores, conectando el perfilado de células inmunitarias con la validación funcional y el cribado.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona pruebas sólidas de hipótesis sobre la función y abundancia de las células inmunitarias de los mosquitos.
- Selección: Establece resultados cuantitativos y reproducibles para ensayos basados en células inmunitarias.
- Análisis: Permite la comparación estadística de poblaciones de hemocitos entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los datos de células inmunitarias con modelos de vectores relevantes para enfermedades en estudios preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo estandarizado y escalable, adaptable a diversos programas de investigación sobre mosquitos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en los estudios de células inmunitarias de mosquitos.
- Valor operativo: Agiliza la preparación de muestras, mejora la reproducibilidad y permite un mayor rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar iniciativas de control de vectores y de mosquitos transgénicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de intervenciones sobre vectores dirigidas al sistema inmunitario.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia técnica en microinyección y manejo de mosquitos.
- Necesita acceso a microinyectores, microscopía y reactivos de tinción.
- Exige estandarización entre equipos para una cuantificación consistente de hemocitos.
- Puede requerir adaptación para otras especies de mosquitos o sistemas modelo.
- Está limitado por los pequeños volúmenes de hemolinfa y la posibilidad de pérdida de muestra si no se realiza con precisión.
