El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

El objetivo general de este procedimiento es determinar cuantitativamente el contenido de hemaglutinina y neuraminidasa virales de la influenza en las vacunas que utilizan anticuerpos dirigidos a epítopos conservados. Esto se logra identificando primero los epítopos conservados. El segundo paso del procedimiento es diluir las muestras de referencia y de vacuna para mejorar la sensibilidad de detección.

El tercer paso es ensamblar el aparato de transferencia de ranuras y cargar las muestras en las ranuras. El cuarto paso del procedimiento es detectar el HA o NA en la membrana utilizando sus respectivos anticuerpos universales. El paso final del procedimiento es cuantificar las cantidades de HA o NA mediante densitometría.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran HA o NA cuantificados frente a sus respectivos antígenos de referencia. Hola, mi nombre es Anwar Hashem. Soy estudiante de doctorado en el laboratorio del Dr. Sean Lee.

Hola, mi nombre es Caroline Grab y soy técnica en el laboratorio del Dr. Sean Lee en el Centro de Evaluación de Vacunas de Health Canada. Hoy demostraremos un procedimiento de bot de ranura utilizado para cuantificar los antígenos HA y NA de los virus de la influenza. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el SRID de inmunodifusión radial simple, o los métodos físicoquímicos, es que no requiere anticuerpos específicos de cepa o subtipo, a diferencia del SRID o de instrumentos sofisticados como los métodos físico-químicos.

Además, debido a que estos anticuerpos se dirigen a los únicos epítopos universalmente conservados de un AR, son útiles como herramientas básicas de investigación para los investigadores interesados. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque pueden encontrar problemas técnicos como la dificultad para bloquear las muestras de vacunas precipitadas, la fuga de muestras entre las ranuras y la pérdida de vacío durante el paso de transferencia, así como un alto fondo en las bandas difusas observado después de la inmunodetección. Sin embargo, prestar atención a algunos pasos clave puede ayudar a resolver estos problemas.

Hoy le demostraremos el procedimiento. Así que comencemos. Para identificar las regiones conservadas, utilizamos alineaciones del grupo W para analizar un total de más de 6 000 secuencias de HA de influenza A del NCBI y encontramos el extremo N de la subunidad dos de HA como la región altamente conservada.

Se calculó la entropía de Shannon y la tasa de conservación para cada posición de aminoácido de las secuencias de consenso identificadas. El epítopo UNI uno que se muestra en rojo se eligió para desarrollar un anticuerpo universal contra HA para el ensayo de transferencia de ranura. Utilizando un enfoque similar, se identificaron dos secuencias universalmente conservadas en todas las gripes, una NA una cerca del sitio enzimáticamente activo y la otra al final de los péptidos terminales con estas secuencias de aminoácidos que se utilizaron como antígenos para generar anticuerpos universales contra NA para el ensayo de transferencia en ranura.

Antes de comenzar el procedimiento de transferencia de ranuras, prepare 20 mililitros de solución de urea de cuatro MO en TBS para la hemaglutinina o la transferencia de ranuras de HA, o 20 mililitros de una solución de 0,01% de érgenos en TBS para la neuraminidasa o la transferencia de ranuras de NA y luego prepare dos litros de tampón de lavado agregando entre 20 a A solución de TBS a una concentración final de 0,1%A continuación, Prepare 80 mililitros de tampón de bloqueo disolviendo leche descremada en polvo hasta una concentración final de 5% de peso a volumen en tampón de lavado. Active la membrana PDF y el metanol durante 15 segundos, seguido de un enjuague de dos minutos en agua destilada doble. Remojar la membrana en TBS hasta el uso de tres hojas de papel de filtro T blot SF en TBS hasta que se usen los estándares de referencia de la vacuna contra la influenza con un contenido predeterminado de HA correspondiente a las cepas de la vacuna que se van a probar.

Se obtuvieron del Centro de Evaluación e Investigación Biológica de EE.UU. o del Instituto Nacional de Normas y Control Biológicos del Reino Unido y se utilizaron para la cuantificación de HA o NA por transferencia de ranura para antígenos de referencia de HA y muestras de vacunas de prueba. Preparar 650 microlitros de stock de antígeno de referencia HA diluido en cuatro MOLO urea TBS a las concentraciones indicadas. A continuación, prepare 650 microlitros de muestras de vacunas de prueba en cuatro MOUREA TBS a tres diluciones diferentes, como 10 x, 20 x y 40 x, para lograr una diferencia doble y permitir que las concentraciones de la muestra se encuentren dentro de la curva estándar para los antígenos de referencia de NA y las muestras de vacunas de prueba.

Preparar 650 microlitros cada uno de los estándares de antígeno NA en 0.01% sugen TBS a las concentraciones enumeradas y un estándar de antígeno se hizo internamente mediante el uso de la página SDS junto con análisis de citometría densa. A continuación, prepare 650 microlitros de muestras de vacunas de prueba en 0,01% de sugen TBS a tres diluciones diferentes, como 10 x, 20 x y 40 x para lograr una diferencia doble y permitir que la concentración de la muestra se encuentre dentro de la curva estándar. Ensamble un aparato de microfiltración bio SF previamente limpio y seco colocando la placa de soporte de la junta en el colector de vacío y la junta del techo en la parte superior.

Coloque las tres hojas húmedas y húmedas de papel de filtro BIO SF sobre la junta. A continuación, la membrana de PVDF previamente empapada. A continuación, coloque la plantilla de muestra en la parte superior de la membrana y apriete los cuatro tornillos con los dedos utilizando un patrón de cruce diagonal para garantizar una aplicación uniforme de la presión sobre la superficie de la membrana Antes de conectar el aparato, verifique que la válvula de tres vías esté configurada para exponer el colector de vacío a la fuente de vacío.

Encienda la bomba y conecte el aparato de puntos biológicos. Asegúrese de que la válvula de flujo esté colocada a un nivel por debajo de los pocillos de muestra para un drenaje rápido y adecuado de las muestras en los siguientes pasos. Repita el paso de apriete de tornillos usando el patrón de cruce diagonal.

Apretar los tornillos mientras se aplica el vacío asegura un sellado más hermético y evita la contaminación cruzada entre pocillos. Luego cambie la válvula de flujo para exponer el colector de vacío al aire y apague la bomba. A continuación, aplique 100 microlitros de TBS a todos los pocillos utilizando un pipeteador multicanal para rehidratar la membrana.

Aplique la solución en el centro del pocillo lo más cerca posible del fondo para cubrir la ranura de manera uniforme. Utilice una punta de pipeta limpia para eliminar las burbujas de aire introducidas. Cambie la válvula de flujo para exponer el colector tanto al aire como al vacío.

Encienda la bomba y drene suavemente el tampón de los pozos colocando un dedo sobre el poro expuesto al aire para regular la cantidad de vacío. Luego cambie la válvula de flujo para exponer el colector al aire. Tan pronto como el tampón se drene por completo de todos los pozos.

Apague la bomba o desconecte la aspiradora. Aplique 200 microlitros de cada dilución de muestra estándar o de vacuna por pocillo. Pipetee las muestras, una a la vez, en el centro de cada pocillo lo más cerca posible del fondo.

Se ha tenido cuidado de evitar y eliminar los aireables. Coloque 200 microlitros de tampón de dilución de muestra en los pocillos no utilizados para garantizar un vacío adecuado en los pocillos en uso. Ajuste la válvula de flujo para exponer el colector tanto al aire como al vacío.

Encienda la bomba de vacío y deje que las muestras se drenen suavemente de los pocillos controlando la cantidad de vacío con un dedo sobre el poro expuesto al aire. Retire el dedo del puerto para liberar la aspiradora. Tan pronto como todas las muestras se hayan drenado inmediatamente.

Agregue 200 microlitros de TBS a cada pocillo. Con una pipeta multicanal, aplique una aspiradora suave para drenar y lavar los pocillos controlando la cantidad de vacío con un dedo sobre el puerto expuesto al aire. Repita el paso de lavado una vez tan pronto como los pocillos se hayan drenado por completo, afloje los tornillos de la plantilla de muestra y apague la aspiradora para evitar un secado excesivo.

Los pocillos proceden inmediatamente a eliminar la membrana y la colocan en un tampón de bloqueo. Usar suficiente tampón para cubrir completamente la membrana. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con un balanceo suave.

Después de la incubación durante la noche y el tampón de bloqueo. Lave la membrana dos veces como se indica, seguido de mecerla para todos los lavados e incubaciones. Asegúrese de que la membrana esté completamente cubierta con la solución.

A continuación, incube la membrana con el anticuerpo universal de conejo uni one contra HA o los anticuerpos universales HCA dash two o HCA dash three para NA diluidos en 5% de peso a volumen BSA en tampón de lavado durante una hora a temperatura ambiente, diluciones de uno a 4, 000 de antisuero de conejo dieron resultados óptimos para estos anticuerpos. Después de esto, lave la membrana tres veces a temperatura ambiente con un balanceo suave durante 15 minutos cada vez. A continuación, incubar la membrana con una dilución de uno a 50.000 de anticuerpo conjugado anti IgG de cabra, anticuerpo conjugado IgG peroxidasa y tampón de bloqueo y tampón de bloqueo incubado durante 30 minutos con un balanceo suave después de la incubación, lavar la membrana y el tampón de lavado tres veces a temperatura ambiente meciendo durante 15 minutos cada uno.

A continuación, lave la membrana con TBS durante cinco minutos con un suave balanceo para eliminar los residuos de detergente tween 20 de la superficie de la membrana. A continuación, prepare el sustrato en desarrollo utilizando tres mililitros de cada reactivo del kit de sustrato de duración extendida Super Signal West Dura y mezcle. Coloque la membrana sobre un papel de seda seco para eliminar suavemente cualquier exceso de tampón TBS antes de transferir a un recipiente seco y aplicar el sustrato, incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente con un balanceo suave y eliminar el exceso de sustrato mediante secado.

Al terminar, exponga la membrana a una película de quimioluminiscencia. La duración de la exposición deberá optimizarse para evitar la saturación de la señal, pero normalmente oscilará entre 10 segundos y 10 minutos. El análisis de citometría densa en la película revelada se realizó utilizando el sistema de documentación de gel florico chem siguiendo las instrucciones del fabricante.

Promedie los valores de densidad para cada conjunto de réplicas de antígenos de referencia y muestras de vacunas de prueba. Se necesitan kits triples para las pruebas de significación y para evaluar el error experimental. Represente los valores de densidad promediados en comparación con la cantidad de antígeno HA o NA en cada ranura.

Tomado de la norma de referencia. Aquí se muestra un modelo logístico de cuatro parámetros para inmunoensayos que utiliza una concentración y densidad de vacunas de referencia para extrapolar la concentración de muestras a partir de la densidad de vacunas de muestras de prueba utilizando un enfoque de ajuste de curva de regresión no lineal de pendiente variable. El gráfico PRISM se utiliza para trazar las curvas estándar y obtener concentraciones a partir de los datos de densidad obtenidos como se muestra aquí.

El anticuerpo universal HA UNI one demostró una notable especificidad para las secuencias virales y es capaz de unirse a 13 subtipos diferentes de gripe. Un AH extraído de fluidos otorrinolaringólogos de huevos de gallina embrionados infectados con virus. La proteína NP es el control de carga.

El control negativo es el líquido otorrinolaringológico de huevos no infectados, y el control positivo es un estándar de referencia de H one de N-I-B-S-C. Las diferencias observadas en la movilidad de las proteínas HA se deben probablemente a variaciones en su tamaño y/o etapa de procesamiento. Como se muestra aquí, los anticuerpos HCA guión dos y HCA guión tres contra ambos epítopos conservados de NA fueron capaces de unirse a los nueve subtipos de NA y mostraron muy poca reactividad cruzada a las proteínas Alan Toic o celulares y el control de la proteína P se muestra en el Panel C. El control positivo es el líquido Alan Toic enriquecido con R NA uno de un corte nueva caledonia slash 20 slash 99 y sondeado con el correspondiente El control de la proteína antisueros NP se muestra en la parte inferior.

Esta imagen muestra resultados representativos similares a los de HA de la cuantificación, el antígeno NA en el estándar de referencia de la vacuna contra la influenza y en muestras de vacunas. El análisis de densidad mostró que la intensidad de la señal obtenida mediante la detección del antígeno NA en varias diluciones de un patrón de referencia de vacuna por slot blot es proporcional a la concentración de na. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tratar previamente las muestras de la vacuna para disolver los materiales sedimentados y garantizar un drenaje adecuado de la ranura.

También se debe tener cuidado con el lote para evitar fugas de muestras entre pocillos. La optimización de las diluciones de anticuerpos y los tiempos de incubación puede ser necesaria para que cualquier nuevo anticuerpo utilizado para la detección obtenga señales nítidas de intensidades ideales mientras se minimiza el fondo después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para los científicos en el campo de la investigación de vacunas contra la gripe.

Futuros análisis cuantitativos de los antígenos HA y NA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar las proteínas de superficie importantes de los virus de la influenza en ensayos simples sin el uso de anticuerpos específicos de la cepa.