Name: Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T09:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprende una técnica no invasiva de muestreo de pelo para obtener ADN de alta calidad de pikas americanos sin perturbarlos. Este método facilita estudios de genética de poblaciones y ecología de mamíferos pequeños esquivos.

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Nos gustaría dar las gracias a L. Evans, B. Granger, Rissling D., Sim Z., A. Garcia, Hayhurst K. y D. Kuch de asistencia en el campo. K. Galbreath amablemente proporcionaron muestras de hígado pika del valle de Bella Coola. Gracias a A. Gonçalves da Silva y K. Larsen para discusiones interesantes que contribuyeron al diseño de este método de muestreo genético no invasivo. Este trabajo fue financiado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá Discovery, y UBC Okanagan becas de investigación individuales de marzo A Fondo Nacional Suizo Fundación de Becas de Doctorado PBSKP3_128523 apoyado PH. Este estudio se realizó siguiendo el protocolo de cuidado de los animales de la Universidad de British Columbia (número de certificado: A07-0126).

1. Pelo trampa Antes de la creación de una trampa, una ubicación ideal tiene que ser determinada en el hábitat del pika o talud. Esto incluye montones de heno, que son escondites de vegetación que los animales se acumulan en verano, así como heces dulce que se encuentra en los sitios de letrina. Tiras de cinta de embalaje (10-50cm de longitud) se acumulan para proporcionar una superficie de 360 ​​° pegajoso y se organizan de una manera similar a una red para envolver a la entrada de la pila de heno la pika (Fig. 1), o sitio de la letrina. Dependiendo de la configuración de las rocas, un trozo de hilo de pescar se puede utilizar para apoyar la estructura de la trampa de pelo, pero a menudo no es necesario cuando las entradas son muy pequeñas (&lt;30cm de diámetro), una descripción completa de la utilización de línea de pesca se puede encontrar en Henry y Russello (2010) 3. Trampas de pelo son verificados siempre que sea posible, las muestras de pelo y depositados en la cinta (Fig. 2) se recogen y se etiqueta. Una vez transportados al laboratorio, los pelos se eliminan de la cinta adhesiva con una pinza estéril y se transfirieron a tubos criogénicos y almacenadas a -20 ° C hasta su posterior manipulación. Las muestras de cabello se agrupan a lo largo de un lazo del pelo se considera que pertenecen a una sola persona, mientras que las muestras agrupadas de forma independiente se supone que pertenecen a diferentes personas. En este último caso, el cabello se coloca en tubos diferentes. Estos supuestos más tarde se puede probar por medio de huellas de ADN y los cálculos de la probabilidad de identidad basado en microsatélites datos genotípicos. 2. Extracción de ADN Puesto que el pelo pika es muy delgada y contiene una bombilla de raíz pequeña, hemos demostrado que un mínimo de 25 pelos están obligados a obtener cantidades suficientes de ADN para la buena calidad de amplificación de PCR abajo 3. Se utilizó el sistema IQ ADN (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y una versión ligeramente modificada de las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ADN de muestras de cabello. En primer lugar, la muestra de cabello se hace girar en una centrífuga de micro-con el fin de evitar la pérdida de cabello, mientras que la apertura del tubo. A continuación, la solución de incubación se prepara mezclando 80 l de solución de incubación con 10μl de la TDT (1M) y 10μl de proteinasa K (18ng/ml) para dar lugar a una concentración final de 0,1 M TDT y 1.8ng/ml de proteinasa K. incubación solución (100 l) se añade a la muestra y se incuba a 56 ° C durante 1 hora. Mientras tanto, la solución de lisis se prepara añadiendo 1 l de DTT (1M) por cada 100 l de tampón de lisis, lo que resulta en una concentración final de 0,01 M de TDT. Solución de lisis preparado (200 l) se añade a la muestra, junto con 7 l de ADN de resina IQ, agitaron durante 3 segundos a alta velocidad y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. La muestra se agitaron durante 2 segundos y se inserta en el soporte magnético, donde la separación de partículas magnéticas de la solución se presenta. La solución restante se aspira y se desecha, teniendo cuidado de no molestar a los pellets de resina magnético. La muestra se trata con 100 l de la solución de lisis preparado, vortex y se devuelve al soporte magnético cuando la separación se produce de nuevo. El tampón de lisis que se aspira y se desecha, y este paso se repite tres veces con un tampón de lavado (100 l). La muestra posteriormente se deja secar en el soporte magnético durante 15 minutos. Una vez seco, 100 l de tampón de elución se añade a la muestra y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos. La muestra se agita y se inserta en el soporte magnético. La solución que ahora contiene el ADN eluido se transfiere a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y almacenadas a -20 ° C hasta más manipulaciones. ADN de muestras de hígado fue extraído utilizando también el sistema de inteligencia del ADN y utilizado como control positivo de amplificación de PCR. 3. Amplificación por PCR El ADN obtenido de nuestro lazo de pelo no invasiva y las muestras de hígado fueron utilizados para amplificar un conjunto de uso común de marcadores moleculares (microsatélites, AFLP, mitocondrial citocromo B y ZFX / ZFY marcador de determinación del sexo). PCR se realizó con un Veriti termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en un volumen de 25 l que contiene: 10 - 20 ng de ADN, 0,5 mM de cada primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, dNTPs 200 mM, a 10 μ de albúmina sérica bovina (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) y 0,5 U AmpliTaq DNA polimerasa de oro (Applied Biosystems). Parámetros de los ciclos de los loci microsatélites se han optimizado mediante un programa de ciclos de touchdown (10 min a 95 ° C, 35 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 30 s recocido, y 45 s a 72 ° C, seguida de una etapa final a 72 ° C durante 10 min). La temperatura de hibridación redujo en un 1 ° C por cada ciclo de 60 a 55 ° C hasta llegar al sexto ciclo, momento en el que los 29 ciclos restantes continuaron a 55 ° C. Parámetros de los ciclos de los fragmentos mitocondrial fueron descritos como más arriba, pero consistió en 35 ciclos con un recocidotemperatura de 50 ° C. Amplificación de fragmentos polimórficos se llevó a cabo siguiendo el protocolo de los genomas de vertebrados descritos por Bonin 4. Por último, sexado molecular se ha realizado mediante la técnica PCR-RFLP de ZFX / ZFY loci con la digestión de la enzima de restricción HinfI 5. Los productos de PCR de la microsatélites, AFLP y las secuencias del citocromo B se realizaron en un analizador genético ABI 3130xl (Applied Biosystems), mientras digiere ZFX / ZFX fragmentos se llevaron a cabo junto a una escalera de 100 pb (New England Biolabs) en un 3% en gel de agarosa que contiene 2,5% en gel de ADN SYBR seguro. mancha (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se visualizan mediante un sistema RED de imagen personal gel (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.) Microsatélites y AFLPs se visualizaron utilizando GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) y el cromatograma de ADN mitocondrial se visualizan mediante Sequencher v4.7 (Código Gene Corporation, de Ann Harbor, MI, EE.UU.). 4. Los resultados representativos El ADN extraído de muestras de cabello obtenido usando nuestro lazo no invasiva se utiliza para amplificar por PCR de varios tipos de marcadores moleculares. Como base de comparación, utilizando ADN extraído de muestras de hígado se amplificó junto con muestras de nuestro cabello. Nuclear loci microsatélites fueron amplificados con éxito, tanto para el cabello y las muestras de hígado (Fig. 3). A pesar de la intensidad de la señal fue mayor cuando se utilizan las muestras de hígado, esto no tuvo un efecto negativo en la puntuación genotipo (Fig. 3). Resultados similares se obtuvieron cuando se utiliza AFLPs (Fig. 4), secuencias de ADN mitocondrial (Fig. 5), y el marcador ZFX / ZFY sexado molecular (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un ejemplo de una trampa de pelo no invasiva creado en una pila de heno. Tiras enrolladas de cinta adhesiva transparente se organizan de una manera similar a una red para cerrar la entrada a la pila de heno. Un pedazo de hilo de pesca se utiliza aquí para ofrecer ayuda adicional a la trampa de pelo. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Una trampa de pelo éxito que contiene una gran cantidad de pelo pegado a la cinta de embalaje. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un cromatograma representativo de microsatélites nucleares (Ocp6) 8 como se muestra en GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). El cromatograma superior se obtuvo mediante la amplificación de ADN de tejido del hígado, y es heterocigoto (354/358) en este lugar. El cromatograma inferior representa una persona diferente exhibiendo un genotipo heterocigoto (358/362), basado en ADN extraído de pelo. Mientras que la señal del cromatograma de la muestra de cabello tiene una intensidad menor que la muestra de hígado, anotando el genotipo no se ve afectada por esta diferencia en la señal. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. AFLP un cromatograma representativo (E31T32) como se muestra en GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). El cromatograma superior se obtuvo mediante la amplificación de ADN de tejido del hígado, el cromatograma inferior representa el ADN extraído de pelo. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Un representante cromatograma secuencia de ADN mitocondrial (citocromo b) como se muestra en Sequencher v4.7 (Gene Código de Sociedades). El cromatograma superior se obtuvo mediante la amplificación de ADN de tejido del hígado, el cromatograma inferior representa el ADN extraído de pelo. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Un marcador representante sexado molecular (ZFX / ZFY) amplificada por el hígado y las muestras de cabello. Este enfoque se basa en la observación de que el cromosoma Y tiene un sitio de restricción HinfI en esta región del cromosoma X no tiene. Por lo tanto, las hembras producen dos migración co-fragmentos de 432 pb, mientras que los machos producen fragmentos de 432 pb, 261 pb y 171.

<ol><li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildlife+Manage%22%5BJournal%5D)">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li>
<li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size%2C+natal+philopatry%2C+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+%28Aquila+heliaca%29+in+central+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li>
<li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li>
<li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Wildlife+Res%22%5BJournal%5D)">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li>
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<li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika%2C+Ochotona+princeps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Notes%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li>
</ol>

Muestreo genético no invasivo se ha convertido en una alternativa atractiva a los tradicionales métodos de captura en vivo por varias razones. En primer lugar, discretamente recolección de material biológico (por ejemplo, heces, pelos, plumas, saliva y moco) de las poblaciones silvestres, los investigadores pueden estudiar estas especies sin alterar, manipular, o incluso la observación, por lo tanto reducir los riesgos para los animales y los investigadores. En segundo lugar, el muestreo genético no invasivo permite a los biólogos para estudiar las poblaciones de especies evasivas y raras, una tarea que puede resultar difícil con más tradicional en vivo que atrapa enfoques 6. Y en tercer lugar, NGS potencialmente puede aumentar tamaño de las muestras mediante la reducción de molestias a los animales, los esfuerzos de muestreo, y los costos, lo que ayuda a minimizar los sesgos en las estimaciones de los parámetros de la población 7. Este último punto puede ser crucial cuando se trata de especies amenazadas, ya que las estimaciones sesgadas de los parámetros de la población puede dar lugar a una gestión inadecuada. En el artículo de vídeo actual se describe un método simple y novedoso, barato y no invasivo para la muestra esquivo pequeños mamíferos, con el estadounidense Pika como un ejemplo. Se demuestra que el ADN extraído de pelo funciona de forma similar al ADN extraído de muestras de hígado con respecto a los microsatélites, AFLP, mitocondrial y marcadores de determinación del sexo, por lo que este método de muestreo no invasivo en una alternativa atractiva para vivir de muestreo trampas o letal. En general, prevemos que este método sea útil en la etapa de recolección de datos de los estudios de genética de la población y del comportamiento de las especies de pequeños mamíferos raros o difícil de alcanzar, mientras que se minimiza el impacto sobre los organismos en estudio.

Pelo trampa: <ul><li> Rollos de cinta adhesiva transparente (3M, St. Paul, MN, EE.UU.) </li><li> La pesca con caña (10 libras) </li><li> Criogénica del tubo (2 ml) </li><li> Pinzas estériles </li><li> Dewar de nitrógeno líquido (opcional) </li></ul> Extracción de ADN: <ul><li> ADN IQ System (Cat. # DC6701; Promega) con el tejido y el kit de extracción de pelo (Cat. # DC6740, Promega). </li><li> MagneSphere soporte tecnología de separación magnética (Cat. # Z5342, Promega) </li><li> Microcentrífuga </li><li> Horno de hibridación o el agua del baño </li><li> Los tubos Eppendorf de 1,5 ml </li></ul>

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

No invasiva de los métodos de muestreo genético son cada vez más importante para el estudio de poblaciones de vida silvestre. Un número de estudios han reportado el uso técnicas no invasivas de muestreo para investigar la genética de poblaciones y la demografía de las poblaciones silvestres 1. Este enfoque ha demostrado ser especialmente útil cuando se trata de especies raras o difícil de alcanzar 2. Aunque algunos de estos métodos han sido desarrollados para el pelo de la muestra, las heces y otros materiales biológicos de los carnívoros y los mamíferos de tamaño mediano, que han permanecido sin probar en difícil de alcanzar pequeños mamíferos. En este vídeo, se presenta una novela, la trampa de pelo barato y no invasivo destinado a un elusivo animal pequeño, el pika americano (Ochotona princeps). Se describe la configuración general de la trampa de pelo, que consiste en tiras de cinta de embalaje dispuestos de una manera similar a una red y se colocan a lo largo de las rutas de viaje en el hábitat de los pikas. Se ilustra la eficacia de la trampa en la recolección de una gran cantidad de pelo que puede ser recogido y llevado al laboratorio. A continuación, mostrar el uso del sistema de ADN IQ (Promega) para aislar el ADN y demostrar la utilidad de este método para amplificar comúnmente utilizados como marcadores moleculares microsatélites nucleares, polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), secuencias mitocondriales (800bp), así como una marcador de sexado molecular. En general, se demuestra la utilidad de esta trampa de pelo nuevo no invasivo como una técnica de muestreo para los biólogos de poblaciones de vida silvestre. Creemos que este enfoque se aplica a una variedad de pequeños mamíferos, la apertura de áreas de investigación dentro de las poblaciones naturales, mientras que minimiza el impacto en los organismos de estudio.

Se presenta un método de muestreo no invasivo para recoger muestras de cabello de manera eficiente difícil pequeños mamíferos, como se muestra en la pika estadounidense. Demostrar la utilidad de este método de extracción de ADN de muestras de cabello y amplificar varios tipos de marcadores moleculares utilizados en los estudios de la ecología de la fauna silvestre y la conservación.

Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

Los enfoques de muestreo genético no invasivo son cada vez más importantes para estudiar las poblaciones de fauna silvestre. Diversos estudios han informado el uso de...

Los genetistas de poblaciones silvestres están utilizando cada vez más enfoques de muestreo no invasivo para obtener datos de sus especies de interés. Dichos enfoques han demostrado ser útiles para investigar cuestiones relacionadas con el comportamiento animal, la población, la demografía y la genética, especialmente en animales raros y escurridizos, ya que al recolectar remotamente materiales biológicos como el pelo, los investigadores pueden estudiar a los animales sin perturbarlos, dañarlos o incluso observar sus especies de interés. Aunque estas técnicas se han aplicado principalmente a carnívoros de tamaño mediano y grande, como osos pardos, se ha centrado menos esfuerzo en mamíferos herbívoros más pequeños para cerrar esta brecha.Se están desarrollando enfoques novedosos e innovadores para muestrear mamíferos pequeños. Este artículo en video describe una forma nueva e innovadora de obtener muestras de pelo de lagomorfos pequeños llamados pica americano sin molestarlos. Estos mamíferos pequeños se encuentran en toda la extensión de las cadenas montañosas de América del Norte, desde Nuevo México y California hasta el centro de Columbia Británica.Habitan en deslizamientos rocosos denominados laderas Tala, que les brindan refugio frente a la depredación, así como protección contra los extremos ambientales. Por lo general, se encuentran a altitudes superiores a 2,500 metros sobre el nivel del mar en la parte sur de su distribución, aunque también pueden hallarse al nivel del mar en la parte más septentrional de su rango. Los pícaros no hibernan.Están activos durante todo el día en verano, pero concentran su actividad en las mañanas y las tardes. Cuando las temperaturas son más frescas, se aventuran a prados adyacentes a la ladera Tali para alimentarse de la vegetación circundante. Una particularidad del PIKA es que no solo come su alimento al aire libre.Lo lleva de regreso a su territorio en el Tallis y lo almacena en pilas de heno. Aunque la especie es fácilmente detectable, es de naturaleza tímida y a menudo evitará las trampas vivas colocadas por los investigadores. Además, se ha encontrado que los pícaros son sensibles al manejo, lo que puede resultar en la muerte del animal para estudiar una variedad de preguntas ecológicas, conductuales y evolutivas.En este evasivo pequeño mamífero, al mismo tiempo que se minimiza el impacto, el candidato doctoral Philippe Henry del campus Okanagan de la Universidad de Columbia Británica ha desarrollado una técnica de muestreo no invasiva muy adecuada para la especie. Antes de colocar una trampa, busca evidencia de territorios activos de PICA en la ladera de Tallis. Esto incluye pilas de heno, que son reservas de vegetación que el animal recolecta a finales del verano para la supervivencia durante el invierno, y excremento fresco.Que generalmente se encuentra en sitios específicos de gran tamaño. Una vez identificado un pico potencial de hábitat dentro del tlu, se coloca estratégicamente una trampa de pelo sobre su entrada. Utilizando un rollo de cinta adhesiva, Philippe enrolla hábilmente tiras de cinta y las dispone de forma aracnoidea para envolver.La entrada de las trampas escondite está elaborada con diseños intrincados que proporcionan un orificio que no es ni demasiado grande ni demasiado pequeño para que el animal pueda atravesarlo. Hipotéticamente, un pika pasará a través del lazo, dejando atrás una muestra de su pelo mientras continúa con sus actividades diarias sin ser molestado. El pelo en sí es muy delgado y presenta una pequeña raíz bulbosa.Con el fin de obtener una muestra adecuada para el análisis, se desea un mínimo de 25 cabellos pertenecientes al mismo individuo. Las ubicaciones de impacto también deben ser distintas a lo largo de la cinta. Se asume que cualquier cabello agrupado independientemente pertenece a individuos separados.Aunque se asume que los agrupados son uno y el mismo, el cabello recolectado puede retirarse cuidadosamente de la cinta con pinzas estériles sin alterar la estructura de la muestra, especialmente el bulbo radicular que contiene la mayor concentración de ADN nuclear. Posteriormente, el cabello se coloca cuidadosamente en un tubo criogénico de dos mililitros y se almacena en un tanque de nitrógeno líquido hasta que la muestra llegue al laboratorio para su análisis posterior. Una vez en el laboratorio, la muestra de cabello se centrifuga en una microcentrífuga para evitar la pérdida del cabello al abrir el tubo; luego, el ADN se extrae de las muestras de cabello utilizando el sistema Promega DNA IQ, siendo el primer paso la preparación de una solución que contiene 100 microlitros de tampón de incubación, 1,8 miligramos por mililitro de proteinasa K y 0,1 molar de DTT.A continuación, se añaden 100 microlitros de la solución de incubación al cabello y se incuba a 56 grados Celsius durante una hora. Luego, la muestra se procesa con 200 microlitros de tampón de lisis que contiene 0,01 molar de DTT y siete microlitros de resina DNA IQ resuspendida. Después, la muestra se agita en vórtex a alta velocidad durante tres segundos y se incuba a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos.La muestra digerida se vuelve a agitar en vórtex durante dos segundos a alta velocidad y se coloca en un soporte de separación magnética. En este punto, la resina magnética que contiene fragmentos de ADN se separa instantáneamente de la solución y se forma un pellet en el fondo del tubo. La solución restante se retira y se desecha.A continuación, la muestra se trata nuevamente con 100 microlitros de tampón de lisis, se mezcla en vórtex y se devuelve al soporte magnético donde ocurre la separación. De nuevo, este mismo paso se repite otras tres veces utilizando un tampón de lavado. Después del lavado final, se deja secar la muestra en el soporte magnético durante 15 minutos.Luego, se agregaron 100 microlitros de tampón de elución a la muestra y se incubó a 65 grados Celsius durante cinco minutos. Finalmente, la muestra se vortexeó durante dos segundos y se colocó en el soporte magnético. La solución de ADN se transfirió entonces a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros y se almacenó a 20 grados Celsius bajo cero.Hasta nuevos análisis, mi nombre es Peter Bohi. Soy candidato al doctorado en el laboratorio de Genómica Ecológica y de Conservación del Dr. Michael Rosso, en el campus Okanagan de la Universidad de Columbia Británica. El ADN extraído del cabello que muestreamos este verano se utilizó luego para amplificar mediante PCR diversos tipos de marcadores moleculares.También utilizamos muestras de hígado como control positivo y base. Para comparar nuestro método, amplificamos loci de microsatélites nucleares que se utilizarán para estudiar la población y la estructura genética en nuestro animal, así como escaneos genómicos A FLP que se emplearán para investigar la base genética de la adaptación a lo largo de un gradiente altitudinal. Asimismo, amplificamos secuencias de ADN mitocondrial de hasta 800 pares de bases que pueden usarse para estudiar la filogeografía de la especie, y aplicamos la herramienta de sexado molecular basada en secuencias de dedo de zinc y P-C-R-R-F-L-P para identificar el sexo de los individuos en nuestras poblaciones.En todos los marcadores analizados, el ADN extraído de muestras de pelo e hígado produjo niveles comparables de calidad en la secuencia de ADN y en el genotipo. En este video, demostramos que este método de muestreo no invasivo, combinado con el protocolo de extracción DNA IQ, es eficaz para obtener cantidades adecuadas de pelo que proporcionen ADN de calidad y cantidad suficientes para la amplificación mediante PCR. En general, anticipamos que este método será útil para facilitar la recolección de datos que apoyen estudios poblacionales, genéticos y conductuales de pequeños mamíferos raros o esquivos, al tiempo que se minimizan los impactos sobre las especies objeto de estudio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El aislamiento de ADN genómico de colas de ratón

El enfoque directo de PCR que aquí se presenta facilita la amplificación por PCR directamente a partir de pequeñas cantidades de planta no purificado y el tejido animal.

El genotipado de muestras de plantas y animales, sin previa purificación del ADN

Tejido análisis específico de un modelo de regeneración del folículo del pelo utilizando lentivirus para mediar ganancia o pérdida de función.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

Aquí se describe una estrategia de extracción optimizado y eficiente para la recogida de bio-partículas presentes en "toque de ADN 'muestras, junto con un protocolo de amplificación mejorada que implica un / STR amplificación de un solo paso 5 l micro-volumen de lisis, para permitir la recuperación de repetición corta en tándem (STR) perfiles del donante (s) bio-partícula.

Mejorado el análisis genético de Soltero biopartículas Humanos Recuperadas por simplificado Micromanipulación de Evidencia Forense &#39;Touch ADN&#39;

En este artículo, se demuestra cómo se realiza la técnica de microbiopsy absorbente y cómo se puede utilizar la muestra para la extracción de RNA para muestreo simple y simultánea de la piel y la sangre de una manera mínimamente invasiva.

Absorbente Microbiopsy muestreo y extracción de RNA de sangre como mínimo invasor, simultánea y análisis de la piel

Este es un protocolo para la preparación óptima del tejido para análisis genómicos, transcriptómicos y proteómicos de murciélagos atrapados en la naturaleza. Incluye protocolos para la captura y disección de murciélagos, la preservación de tejidos y el cultivo celular del tejido murciélago.

Colección de tejidos de murciélagos para análisis de émica y cultivo celular primario

El protocolo actual presenta un método rápido, eficiente y suave para aislar células individuales adecuadas para el análisis de ARN-seq de una sola célula a partir de un incisivo de ratón en crecimiento continuo, molar de ratón y dientes humanos.

Aislamiento rápido de células individuales de dientes de ratón y humanos

El protocolo presenta una serie de protocolos de mejores prácticas para la recolección de polvo óseo de ocho ubicaciones de muestreo anatómico recomendadas (ubicaciones específicas en un elemento esquelético dado) a través de cinco elementos esqueléticos diferentes de individuos medievales (radiocarbono fechado en un período de ca. 1040-1400 CE, rango calibrado 2-sigma).

Protocolos optimizados de muestreo óseo para la recuperación de ADN antiguo de restos arqueológicos

Aquí, presentamos un protocolo sencillo para el muestreo genético no invasivo de poblaciones de mariposas basado en la recolección de residuos de huevos residuales. Se puede utilizar para confirmar la identidad de la especie y cuantificar la variación genética. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a grupos más amplios para la participación de la ciencia comunitaria.

Despliegue de científicos comunitarios para realizar muestreos genéticos no destructivos de poblaciones de mariposas raras

Aprende una técnica no invasiva de muestreo de pelo para obtener ADN de alta calidad de pikas americanos sin perturbarlos. Este método facilita estudios de genética de poblaciones y ecología de mamíferos pequeños esquivos.

Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

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