Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los efectos de diversas manipulaciones moleculares y farmacológicas sobre la morfología y motilidad de la espina dendrítica. Esto se logra mediante la seccionamiento de neuronas corticales primarias cultivadas con GFP, con o sin expresión exógena de plásmidos de ADN para delinear la morfología neuronal y manipular la expresión y función de proteínas endógenas. En el segundo paso, las células pueden tratarse farmacológicamente y posteriormente fijarse en una tinción inmunológica o prepararse para la obtención de imágenes de lapso de tiempo.

Y luego el tratamiento farmacológico, que permitirá la visualización de las espinas dendríticas y los cambios inducidos en la morfología y motilidad de la espina dendrítica. Las imágenes de la serie Z de células fijas o imágenes de células vivas tomadas en puntos de tiempo específicos se adquieren utilizando un microscopio confocal. Las mediciones detalladas de la morfología de la espina dendrítica se pueden realizar a partir de proyecciones 2D de imágenes de la serie Z.

Los resultados obtenidos muestran el efecto de las manipulaciones moleculares o farmacológicas sobre la morfología o motilidad de la espina dendrítica basadas en el análisis morfológico cuantitativo de la forma o motilidad de la espina dendrítica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, como ¿cómo se regula la plasticidad sináptica? ¿Cómo se desarrollan las sinapsis excitatorias?

¿Cómo se mantienen o eliminan las sinapsis? ¿Cómo regulan las moléculas, como los neurotransmisores o los genes, la estructura de la sinapsis? Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos básicos que subyacen a la regulación de las sinapsis, también se puede implicar que investiga la contribución de los genes asociados a la enfermedad para alterar la estructura de la sinapsis, que es un sello distintivo de una serie de trastornos psiquiátricos y neurológicos como el autismo, la esquizofrenia o la enfermedad de Alzheimer.

Primero, prepare H-D-M-E-M equilibrando el pH de DMEM con hippies estériles de 10 milimolares. Caliéntalo a 37 grados centígrados. A continuación, transfiera cubreobjetos de 18 milímetros con células a 600 microlitros de 37 grados Celsius de medios precalentados y libres de antibióticos.

Incubar las células a 37 grados centígrados y complementarlas con un 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Para cada cubreobjetos, agregue una cantidad designada de ADN a 50 microlitros de H-D-M-E-M y déjelo reposar durante cinco minutos. Luego agregue cuatro microlitros de lipo 2000 a otros 50 microlitros de H-D-M-E-M y también déjelo reposar durante cinco minutos.

Mezcle bien los dos tubos y manténgalo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados, suplementada con un 5% de dióxido de carbono durante al menos 20 minutos. A continuación, agregue la mezcla gota a gota a las celdas. Continúe incubando las células en las mismas condiciones durante otras cuatro horas, mezcle 300 microlitros de medios de alimentación preparados anteriormente con 400 microlitros de 37 grados centígrados.

Medios de alimentación frescos. A continuación, transfiera los cubreobjetos con celdas al medio que contiene tanto el medio de alimentación viejo como el fresco. Permita que la expresión de plásmidos continúe durante otros dos o tres días.

Prepare un líquido cefalorraquídeo con 200 micromolares D-L-A-P-V. Caliéntelo a 37 grados centígrados A continuación, preincube. La cubierta se desliza en 900 microlitros de CSF A caliente durante 30 a 60 minutos.

Prepare el agente farmacológico a partir de la solución madre a una concentración de trabajo de 10 veces diluyendo la solución con un líquido cefalorraquídeo A. Agregue cuidadosamente el agente a las células hasta un volumen final de 1000 microlitros y una concentración final de un agente X. Fije las neuronas en 800 microlitros de 4% de formaldehído, 4% de sacarosa PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Lávelos dos veces en PBS con cuidado al desechar los desechos de formaldehído. A continuación, fije las neuronas con 800 microlitros de metanol precargado a cuatro grados centígrados en un bloque de hielo durante 10 minutos. Lave los cubreobjetos dos veces en 800 microlitros de PBS cada vez durante 10 minutos.

A continuación, los ojos permeables y las células de bloqueo simultáneamente en PBS que contienen un 2% de suero de cabra normal y 800 microlitros de 0,1% de tritton X 100 durante una hora. A temperatura ambiente, agregue anticuerpos primarios generados contra GFP y etiqueta de epítopo o proteínas endógenas a PBS que contenga un 2% de suero de cabra normal. Luego toma un plato de 15 centímetros, divídelo en cuadrados.

Numéralos y cúbrelos con paraforme. Agregue 80 microlitros de mezcla de anticuerpos y bloques a la paraforma a una gota por cuadrado. Coloque el cubreobjetos sobre el anticuerpo y bloquee la mezcla con las células hacia abajo.

Ahora selle el plato con param e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave los cubreobjetos en PB S3 cada vez durante 15 minutos. Anticuerpos secundarios conjugados con Alexa diluidos en PBS que contienen un 2% de suero de cabra normal.

Incubar los anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante una hora y protegerlos de la luz después de eso. Vuelva a lavar las células en PB S3 cada vez durante 15 minutos. Por último, monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio estándar utilizando el reactivo Antifa prolongado Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 63 x con una apertura numérica de 1,4.

Adquiera una secuencia de imágenes como una serie Z en incrementos predeterminados. Por ejemplo, 0,37 micrómetros. Adquiera imágenes fluorescentes con la línea láser adecuada.

Por ejemplo, el uso de un láser de argón línea exci a 488 nanómetros y un filtro de paso de banda a 505 a 530 nanómetros. Ajuste la ganancia y el desplazamiento del detector para crear un contraste nítido entre la señal fluorescente en el lomo y el fondo. Mantenga los mismos parámetros de adquisición para todos los escaneos dentro del mismo experimento.

El software Metamorph de dispositivos moleculares se utiliza para el análisis de imágenes para examinar las morfologías de las espinas dendríticas, el colapso, las imágenes de la serie Z con reconstrucciones de proyección máximas y las imágenes de sustracción de fondo. A continuación, seleccione la neurona que tenga al menos dos dendritas de 100 micrómetros en total y calibre la distancia requerida. A continuación, cree una imagen binaria de la neurona ajustando el umbral de la imagen para incluir todas las espinas de forma que el umbral corresponda exactamente al contorno de las espinas.

Mida las espinas solo en las dendritas secundarias y terciarias para reducir la variabilidad. Realice las mediciones de segmentos entre puntos de bifurcación. Delinee cada lomo manualmente para formar un parámetro cerrado.

Mida los parámetros de la columna vertebral, incluida la longitud de la columna, la columna vertebral, la respiración, el área de la sección transversal y la densidad lineal de la columna dendrítica con metamorfosis. A continuación, exporte los parámetros morfométricos de la espina dendrítica a Excel para su cuantificación y análisis estadístico. Preincubar las neuronas cultivadas en cubreobjetos de 22 por 22 milímetros en 1,5 mililitros de LCR A durante 30 a 60 minutos.

En una incubadora humidificada a 37 grados centígrados, suplementada con un 5% de dióxido de carbono. A continuación, transfiera las células a una cámara de etapa de imagen cerrada a 37 grados Celsius para examinar la motilidad de la columna vertebral, elija neuronas sanas con morfologías perales que expresen cereza GFPM o proteína fluorescente para minimizar el daño fotográfico. Reduzca la potencia del láser a 0,5 a 1 %A continuación, adquiera imágenes con un objetivo de 63 aumentos y una apertura numérica de 1,4 con un promedio de dos aumentos cada 10 minutos.

Toma imágenes de las neuronas durante una hora. A continuación, perfunda el fármaco o el vehículo a la cámara de diagnóstico por imágenes mediante una bomba peristáltica. Las neuronas durante una hora más.

Recoja imágenes de la serie Z en cada punto de tiempo al final de cada sesión de imágenes, obtenga una imagen de 10x de toda la neurona para determinar el nivel de daño fotográfico y omita las neuronas que muestran signos de angustia de la cuantificación Próximo colapso, imágenes de la serie Z de cada punto de tiempo como reconstrucciones de proyección máxima en metamorfosis, Dependiendo de la calidad de la imagen y el nivel de transfección, aplique un filtro de paso medio o una sustracción de fondo para producir imágenes claras para el análisis Para evaluar la morfología y la motilidad de la columna vertebral Código de color e imágenes superpuestas tomadas al principio, medio y final de las sesiones de imágenes de 100 minutos en Metamorph, analice al menos 100 micrómetros de dendrita por celda. La fracción total de motilidad de la columna vertebral se define como el número total de eventos de motilidad. Por ejemplo, la retracción de la extensión, la transformación de la cabeza o la motilidad protrusiva normalizada al número de espinas.

Este método mide la frecuencia de los eventos sin tener en cuenta sus magnitudes y es una estimación general de la motilidad general. Un evento protrusivo se definió como la aparición de una nueva protrusión transitoria de la cabeza de una columna vertebral o del eje dendrítico. Un evento de retracción se definió como la desaparición de una protuberancia existente o transitoria ubicada en la cabeza de una columna vertebral o en el eje dendrítico.

La suma de los eventos de protrusión y extensión se divide por el número total de espinas en la región de la dendrita que se cuantifica para evaluar los cambios en la morfología individual de la columna vertebral en respuesta al tratamiento farmacológico. Mida el área de la sección transversal de las espinas dendríticas o la densidad lineal de la espina dendrítica al comienzo de la sesión de imágenes, y luego en cada punto de tiempo inmediatamente antes y después del tratamiento de perfusión, normalice cada punto de tiempo a la hora anterior al punto de tiempo del tratamiento. A continuación, exporte los parámetros morfométricos de la espina dendrítica a Excel para su cuantificación y análisis estadístico.

Aquí hay un ejemplo para mostrar que las áreas de las microesferas fluorescentes de 0,52 y 1,0 micrómetros como 0,21 micrómetros cuadrados y 0,78 micrómetros cuadrados respectivamente se miden con precisión incluso para las microesferas de 0,2 micrómetros. Las medidas son bastante cercanas a las dimensiones reales. Aquí se muestra una imagen representativa de una neurona cortical transfectada con GFP imageizada con un microscopio confocal con un objetivo de 63 x y una apertura numérica de 1,4.

Aquí están las imágenes detalladas de alta resolución de las espinas dendríticas. Un efecto bien caracterizado de los estímulos dependientes de la actividad es un aumento en el tamaño de la espina dendrítica. Aquí hay una imagen representativa de lapso de tiempo de una columna dendrítica de una neurona cortical DIV 24 que expresa EGFP fotografiada durante 30 minutos antes y después de un estímulo dependiente de la actividad.

Este experimento de lapso de tiempo confirma que el aumento en el tamaño de la columna dendrética se debe a estímulos dependientes de la actividad: Para examinar la columna basal, las imágenes de motilidad se adquieren en el tiempo 0,0, 50 y 100 minutos. Las extensiones de la columna vertebral, las retracciones, la protrusión, la motilidad y la transformación de la cabeza se miden por separado y se combinan como motilidad total. Estas cifras confirman que, incluso en condiciones basales, las espinas dendríticas de las neuronas corticales muestran cierto nivel de motilidad después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la colocalización de receptores con otras proteínas sinápticas, la localización de proteínas en sinapsis y las investigaciones electrofisiológicas para responder preguntas adicionales sobre la regulación de la morfología de la espina dendrítica y la coordinación con la función sináptica. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis detallado de la morfología y la motilidad de la espina dendrítica para evaluar los efectos de diversas manipulaciones moleculares y farmacológicas en la estructura de la sinapsis.