Name: Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende a analizar la morfología y motilidad de espinas dendríticas en neuronas corticales primarias cultivadas mediante transfección con GFP, tratamientos farmacológicos e imagen confocal.

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Damos las gracias a Kelly Jones para la edición de cuidado. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención R01MH 071316, la Asociación de Alzheimer, la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD), y la Alianza Nacional para la Investigación del Autismo (NAAR) (PP), la American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de América Becas predoctorales Heart Association (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

La producción de este trabajo fue apoyado por MetaMorph (Molecular Devices, Inc.).

Las técnicas descritas anteriormente para el análisis cuantitativo detallado de la morfología de la espina dendrítica, densidad lineal y la movilidad en fijos o en vivo las neuronas corticales primaria se centran en la comprensión de los efectos de la post-sináptica mecanismos que pueden contribuir a neuropatologías. Un enfoque similar puede utilizarse para cuantificar la morfología de la columna vertebral o de la motilidad en cualquier neurona espinosa, incluyendo piramidales del hipocampo, Purkinje, o neuronas espinos...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> 18 mm redonda cubierta de vidrio N º 1.5 </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 mm cuadrados cubierta de vidrio N º 1.5 </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64 hasta 0721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> 70 MW ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Los medios de comunicación Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascenso Científico </td><td> Asc-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25-060 C-1 </td><td> 1 M, pH 7 </td></tr><tr><td> Solución de formaldehído </td><td> EMD Chemicals </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, grado histológico </td></tr><tr><td> Las cabras de suero normal </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson ImmunoResearch Labs. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros orgánicos </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (H + L) muy transversal adsorbido </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG (H + L) * muy transversal adsorbido * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reactivo Antifade Oro </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Embalaje especial </td></tr><tr><td> Imágenes de cámara cerrada la etapa </td><td> Warner </td><td> RC-30 HV </td><td></td></tr><tr><td> Unidad de control de temperatura </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> Universal Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del snc cultivadas

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Las espinas dendríticas son los sitios de la mayoría de las conexiones excitatorias en el cerebro, y forman el compartimiento de post-sináptica de las sinapsis. Estas estructuras son ricas en actina y han demostrado ser altamente dinámico. En respuesta a la plasticidad clásica Hebb así como señales de neuromoduladores, las espinas dendríticas pueden cambiar de forma y número, que se cree que es fundamental para el perfeccionamiento de los circuitos neuronales y la transformación y el almacenamiento de información dentro del cerebro. Dentro de las espinas dendríticas, una compleja red de proteínas de enlace de señales extracelulares con la cyctoskeleton actina que permite el control de la morfología de la espina dendrítica y el número. Estudios neuropatológicos han demostrado que un número de estados de enfermedad, que van desde la esquizofrenia hasta trastornos del espectro autista, mostrar la morfología anormal de la espina dendrítica o números. Por otra parte, recientes estudios genéticos han identificado mutaciones en muchos genes que codifican las proteínas sinápticas, lo que lleva a sugerir que estas proteínas pueden contribuir a la plasticidad de la columna vertebral aberrante que, en parte, la base de la fisiopatología de estos trastornos. Con el fin de estudiar el papel potencial de estas proteínas en el control de las morfologías dendríticas columna / número, el uso de cultivos de neuronas corticales ofrece varias ventajas. En primer lugar, este sistema permite obtener imágenes de alta resolución de las espinas dendríticas en las células fijadas, así como time-lapse de imágenes de células vivas. En segundo lugar, este sistema in vitro permite una fácil manipulación de la función de proteínas mediante la expresión de las proteínas mutantes, caída por las construcciones shRNA, o tratamientos farmacológicos. Estas técnicas permiten a los investigadores comienzan a analizar el papel de las enfermedades asociadas a proteínas y para predecir cómo las mutaciones de estas proteínas pueden funcionar in vivo.

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Las espinas dendríticas son los sitios donde se encuentran la mayoría de las conexiones excitatorias dentro del cerebro y forman el compartimento postsináptico de las sinapsis. Estas...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar los efectos de diversas manipulaciones moleculares y farmacológicas sobre la morfología y la motilidad de las espinas dendríticas. Esto se logra seccionando neuronas corticales primarias cultivadas con GFP, con o sin expresión exógena de plásmidos de ADN para delinear la morfología neuronal y manipular la expresión y función de proteínas endógenas. En el segundo paso, las células pueden tratarse farmacológicamente y posteriormente fijarse para inmunotinción o prepararse para imágenes de lapso de tiempo.Luego, un tratamiento farmacológico que permitirá la visualización de las espinas dendríticas y los cambios inducidos en la morfología y motilidad de las espinas dendríticas. A continuación, se adquieren imágenes en serie Z de células fijadas o imágenes de células vivas tomadas en puntos de tiempo específicos mediante un microscopio confocal. Pueden realizarse mediciones detalladas de la morfología de las espinas dendríticas a partir de proyecciones 2D de las imágenes en serie Z.Los resultados obtenidos muestran el efecto de manipulaciones moleculares o farmacológicas sobre la morfología o la motilidad de las espinas dendrítica

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Pekarek, B. T., et. al., Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas mediante la limpieza de tejidos CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)En este video, demostramos la preparación, la obtención de imágenes y el análisis de un cerebro de ratón aclarado para examinar los ejes dendríticos, la morfología de la columna vertebral y la distribución neuronal utilizando técnicas de microscopía confocal y reconstrucción 3D.

Imágenes de microscopía confocal de árboles dendríticos intactos y morfología de la columna vertebral en un cerebro de ratón despejado

Fuente: Gouder, et. al. Cuantificación tridimensional de espinas dendríticas a partir de neuronas piramidales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2015).Este video demuestra la obtención de imágenes y el análisis de espinas dendríticas en neuronas piramidales transducidas e inmunomarcadas mediante microscopía confocal. Se reduce el ruido de fondo y se rastrean las dendritas estimando su diámetro y longitud. La segmentación automatizada de la columna...

Cuantificación de espinas dendríticas mediante imágenes de microscopía confocal

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Describimos dos métodos para la visualización y cuantificación de la arborización dendrítica en el hipocampo de modelos de ratón: imágenes en tiempo real y de profundidad de campo extendida. Mientras que el primer método permite un sofisticado trazado topográfico y la cuantificación de la extensión de la ramificación, el segundo permite una visualización rápida del árbol dendrítico.

Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Aquí presentamos un protocolo de Golgi-Cox en detalle extenso. Este método fiable de tinción de tejidos permite una evaluación de alta calidad de la citoarquitectura en el hipocampo, ya lo largo de todo el cerebro, con un mínimo de resolución de problemas.

Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

Las espinas dendríticas son características celulares importantes del sistema nervioso. Aquí se describen los métodos de imágenes en vivo para evaluar la estructura y función de las espinas dendríticas en C. elegans. Estos enfoques apoyan el desarrollo de pantallas mutantes para genes que definen la forma o función de la columna dendrítica.

Imágenes de espinas dendríticas en Caenorhabditis elegans

El protocolo describe una modificación del método rápido de Golgi, que se puede adaptar a cualquier parte del sistema nervioso, para teñir las neuronas en el hipocampo y la corteza prefrontal medial de la rata.

Tinción rápida de Golgi para la visualización de la columna dendrítica en el hipocampo y la corteza prefrontal

Las espinas dendríticas son compartimentos postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitatorias. Las alteraciones en la morfología de la espina dendrítica ocurren durante el neurodesarrollo, el envejecimiento, el aprendizaje y muchos trastornos neurológicos y psiquiátricos, lo que subraya la importancia de un análisis confiable de la columna dendrítica. Este protocolo describe la cuantificación de la morfología de la espina dendrítica de forma precisa y reproducible utilizando un software...

Cuantificación de la columna dendrítica mediante un software automático de reconstrucción de neuronas tridimensional

Aprende a analizar la morfología y motilidad de espinas dendríticas en neuronas corticales primarias cultivadas mediante transfección con GFP, tratamientos farmacológicos e imagen confocal.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

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