Name: Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Aprende la hibridación in situ en montaje completo para estudiar patrones de expresión génica en embriones de ratón E8.5-E11.5. Este protocolo robusto utiliza sondas ribo específicas y detección inmunohistoquímica.

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<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los métodos descritos en este protocolo ha sido adaptado de una serie de fuentes diferentes y optimizado para montaje en toda E8.5-E11.5 embriones día de vida del ratón. Los métodos para montar toda la hibridación in situ de embriones de los vertebrados aparecieron por primera vez a principios de 1990 2,5-12. Este protocolo fue adaptado sobre todo de los métodos desarrollados para embriones de Xenopus 7,8 y 2,11 ratón. En nuestro protocolo de una gran cantidad de se hac...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Digoxigenina-11-uridina-5&#39;-trifosfato </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleósido Set trifosfato </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Columnas Un paseo rápido por la purificación de ARN radiomarcado </td><td> Suministro </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasa </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polimerasa </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 ARN polimerasa </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 Ci </td><td> Reactivo </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I recombinante, libre de RNasa </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urea, cristales incoloros a blancos o polvo cristalino </td><td> Reactivo </td><td> Pescador </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel de tampón de carga </td><td> Reactivo </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Suministro </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Equipo </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Heparina sódica </td><td> Reactivo </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> peróxido de hidrógeno al 30% en agua </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glutaraldehído, el 8% de grado EM </td><td> Reactivo </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> Utilizar con precaución de acuerdo con las instrucciones del fabricante de </td></tr><tr><td> El bloqueo de los reactivos </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Convertirlo en un 5% de acciones y almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa A </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Hacer como 10 mg / ml y almacenar a -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNasa T1 </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura formamida </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisol clorhidrato </td><td> Reactivo </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido ribonucleico de la levadura torula, Tipo VI </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> fenol / cloroformo y precipitado en varias ocasiones, se resuspendió en DEPC dH2O y se almacenan a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-AP Fab fragmentos </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM púrpura AP sustrato, lo que precipitó. Listo para usar la solución. </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ml, transparente, cerrado arriba, Vial de almacenamiento de conveniencia para la antorcha </td><td> Suministro </td><td> Científica nacional </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Shake N Hornee horno de hibridación </td><td> Equipo </td><td> Boekel Científico </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsia del Seguro-Tek </td><td> Suministro </td><td> Fisherbrand </td><td> 15 a 200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Además Paraplast tejido medio de inclusión </td><td> Reactivo </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Pele-A-Way moldes de plástico desechables tejido incrustación </td><td> Suministro </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Además Colorfrost Portaobjetos </td><td> Suministro </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Red nuclear </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reactivo </td><td> Richard Allan-Científico </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

todo el monte in situ la hibridación de e8.5 a e11.5 embriones de ratón

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Todo el montaje hibridación in situ es un enfoque muy informativo para la definición de patrones de expresión genética en los embriones. La hibridación in situ en los procedimientos son largos y técnicamente exigente con varios pasos importantes que en conjunto contribuyen a la calidad del resultado final. Este protocolo describe en detalle varios pasos clave de control de calidad para el etiquetado de la optimización de la sonda y el rendimiento. En general, el protocolo ofrece una descripción detallada de las medidas necesarias fundamental para obtener resultados de alta calidad reproducible. En primer lugar, se describe la generación de digoxigenina (DIG) marcado con sondas de ARN mediante transcripción in vitro de las plantillas de ADN generados por PCR. Se describen tres ensayos críticos de control de calidad para determinar la cantidad, la integridad y la actividad específica de la etiqueta DIG-sondas. Estos pasos son importantes para la generación de una sonda de la sensibilidad suficiente para detectar ARNm endógeno en un embrión de ratón entero. Además, se describen los métodos para la fijación y almacenamiento de E8.5-E11.5 embriones de ratón días de edad para la hibridación in situ. A continuación, se describen los métodos detallados para la digestión de proteinasa K limitado de los embriones rehidratado seguido de los detalles de las condiciones de hibridación, lavados post-hibridación y el tratamiento de RNasa para eliminar inespecíficos hibridación de la sonda. Un anticuerpo AP-conjugado se utiliza para visualizar la sonda marcada y revelar el patrón de expresión de la transcripción endógena. Los resultados representativos se muestran a partir de experiencias exitosas y las típicas experiencias óptimas.

Este monte se<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridación se analizan los pasos críticos que garantizan resultados reproducibles de alta calidad para estudios de expresión génica en E8.5-E11.5 embriones de ratón días de edad.

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

La hibridación in situ en embriones enteros es un enfoque muy informativo para definir los patrones de expresión génica en embriones. Los procedimientos de hibridación in situ...

El objetivo general de este procedimiento es definir los patrones de expresión génica en embriones completos de ratón. Esto se logra primero diseñando y generando una sonda ribo específica para el gen de interés. A continuación, se recolectan los embriones y se tratan para hibridación.Luego, la sonda marcada se hibrida con los embriones. El paso final consiste en visualizar la sonda hibridada mediante detección inmunohistoquímica. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran los patrones de expresión génica en embriones completos o en secciones embrionarias.Después de obtener imágenes con un microscopio estereoscópico, un microscopio de disección o un microscopio de campo claro convencional, por lo general las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los procedimientos de hibridación in situ son largos y técnicamente exigentes, y existen múltiples pasos importantes que contribuyen colectivamente a la calidad del resultado final. Primero, genere ADN molde amplificando la secuencia de interés mediante cebadores específicos de genes para PCR, diseñados con secuencias promotoras de transcripción de ARN en los extremos cinco primas. Luego, purifique el product

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

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Biología

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Presentamos aquí un protocolo optimizado para genotipar, teñir y preparar ratones fetales para la obtención de imágenes de proyecciones de axones nociceptores periféricos en todo el animal, como un método eficaz para evaluar los fenotipos de crecimiento sensorial de axones en ratones modificados genéticamente en desarrollo.

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