Name: Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende el ensayo de aglutinación de partículas para identificar poliovirus de forma rápida usando partículas de gelatina sensibilizadas. Este método simplifica el diagnóstico virológico y reduce el tiempo de análisis.

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Estamos muy agradecidos a Junko Wada por su excelente asistencia técnica. Estamos agradecidos con el profesor Akio Nomoto de la amabilidad de ofrecer un vector de expresión de baculovirus para el PVR-IgG2a. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones-en-Ayudas a la Promoción de la Erradicación de la Poliomielitis y la Investigación Emergentes y Re-emergentes enfermedades infecciosas del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar Social.

1. Preparación de medio de mantenimiento (MM) y el crecimiento medio (GM) Para la preparación de MM y GM, consulte un manual de laboratorio Polio de la OMS 1. Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 2% de suero fetal bovino (FCS) y el 10% de FCS podrían ser utilizados como sustitutos de la MM y GM, respectivamente. 2. Preparación de anticuerpos anti-PV <ol><li> Reconstituir anti-PV anticuerpos (RIVM PV escribiendo antisuero) mediante la adición de agua (0,5 ml por vial) a cada vial de anticuerpos anti-PV (tipo 1, 2, ó 3). Añadir este anticuerpo soluciones reconstituida (0,5 ml cada una) a 4,5 ml de MM por separado en tubos etiquetados. Nota: Algunos lotes de anticuerpos anti-PV se proporcionan en forma reconstituida (0,5 ml por vial). Para muchos de estos anticuerpos anti-PV, la adición de agua para la reconstitución no es necesario. </li><li> Mezcla de igual volumen de reconstitución anti-PV anticuerpos. Para anti-PV1 2, 2 3, o un 3: Mezclar 1,8 ml de cada anticuerpo reconstituida (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml de cada mezcla). Para anti-PV1 +2 +3: Mezclar 1,2 ml de cada anticuerpo reconstituida (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 ml). Nota: las muestras PV podría contener una mezcla de diferentes serotipos de la energía fotovoltaica. Para identificar el serotipo único de la energía fotovoltaica en las muestras con mezcla de valores actuales, las mezclas de anticuerpos anti-PV (es decir, 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) es necesario. </li><li> Añadir un volumen 1 / 5 de FCS (0,72 mL) a cada anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, o 1 +2 +3) de anticuerpos (3,6 ml cada una) (final de 18,2% FCS). Nota: La adición de FCS es para la reducción de la no-específicas de aglutinación de partículas de gelatina causada por anticuerpos. </li><li> Mantenga las piscinas de anticuerpos a -20 ° C hasta su uso en el ensayo de PA. </li></ol> 3. La reconstitución de las partículas de gelatina sensibilizada <ol><li> Añadir 1,5 ml de solución tampón de reconstitución incluido en el kit a un vial de partículas de gelatina sensibilizada (siempre como polvo liofilizado). </li><li> Mezclar bien con unos golpecitos suaves </li><li> Mantener la partícula reconstituido sensibilizados a 4 ° C. De partículas de gelatina reconstituido puede estar activo al menos 2 semanas se mantiene a 4 ° C, pero debe estar preparado justo antes de la prueba. </li></ol> Nota importante: No mezcle muy diferente de las partículas de gelatina sensibilizada, porque la imagen no aglutinación de partículas de gelatina sensibilizada puede ser diferente por la gran cantidad de las partículas. Para cada experimento, un solo lote de partículas de gelatina sensibilizada debe ser utilizado. 4. PA ensayo para la identificación de PV <ol><li> Prepare una placa de micro-titulación. Para la identificación de la muestra de un virus, es necesario + 5 pozos por lo menos un control negativo (partículas sensibilizadas, sin virus y anticuerpos, así # 6 en adelante. Véase el control de virus y anticuerpos en el ejemplo). El número total de pozos es de 5 x + muestras al menos un control en el ensayo. Nota importante: Por favor, tome por lo menos un no control de virus y anticuerpos en el ensayo. Un vial de partículas sensibilizadas es aproximadamente para la identificación de 10 muestras de virus. </li><li> Añadir 12 l / pocillo de anticuerpos anti-PV o GM a la placa de micro-titulación. La disposición de la placa es el siguiente (ver también el ejemplo más abajo). En las muestras sin anticuerpos (también # 1 y 6), añadir 12 l de GM en lugar de anticuerpos anti-PV. Nota importante: Si muchas muestras de PV debe ser probado en este ensayo, pipetas multicanal o dispensador sería de gran ayuda para este paso. <table border="1"><tbody><tr><td> Bueno # 1 </td><td> Bueno n º 2 </td><td> Bueno # 3 </td><td> Bueno # 4 </td><td> Bien # 5 </td><td> Así # 6 </td></tr><tr><td> GM </td><td> anti-P1 +2 +3 </td><td> anti-P1 +2 </td><td> anti-P2 3 </td><td> ani-P1 3 </td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li> Añadir 12 l / pocillo de muestra del virus. En una muestra sin virus (y # 6), añadir 12 l de GM en vez de la solución de virus. Nota: La muestra del virus es el sobrenadante del cultivo de las células infectadas, las células suelen L20B o células RD. Nota importante: Si muchas muestras de PV debe ser probado en este ensayo, pipetas multicanal sería de gran ayuda para este paso. <table border="1"><tbody><tr><td> Bueno # 1 </td><td> Bueno n º 2 </td><td> Bueno # 3 </td><td> Bueno # 4 </td><td> Bien # 5 </td><td> Así # 6 </td></tr><tr><td> de muestras de virus </td><td> de muestras de virus </td><td> de muestras de virus </td><td> de muestras de virus </td><td> de muestras de virus </td><td> GM </td></tr></tbody></table></li><li> Tome la solución reconstituida de partículas sensibilizadas a 4 ° C a la temperatura ambiente, y golpee suavemente para suspender por completo las partículas. Nota importante: Después de la suspensión completa de las partículas con unos golpecitos suaves, las partículas se debe agregar de inmediato a las placas antes de las partículas en suspensión precipitaciónte y la forma no homogénea solución. </li><li> Añadir 25 l / pocillo de partículas sensibles a todos los pozos. Nota importante: Después de la adición de partículas sensibilizadas, la placa debe ser inmediatamente sometidos a la placa de mezcla para empezar la reacción uniforme de las muestras. Por lo tanto, la adición de partículas sensibilizadas se debe realizar mediante el uso de dispensadores de reducir al mínimo un lapso de tiempo entre las muestras de la placa. </li><li> Coloque la placa de micro-titulación en un mezclador de la placa y la mezcla de la placa durante 30 segundos. </li><li> Coloque la placa de micro-titulación en papel blanco (para mayor comodidad de la observación visual) en una mesa a temperatura ambiente (15 ~ 30 ° C) durante 2 h. Nota importante: No mueva el plato durante y después de la reacción para la observación de los resultados y tomar fotos. La aglutinación formado no es estable y fácilmente perturbados por movimiento de las placas. </li><li> Tomar fotos de la placa. Nota importante: Vista parcial de las fotos no podía dar datos suficientes para su posterior examen y revisión de los resultados para su interpretación. Varias fotos deben ser tomadas para cubrir todos los pocillos de las placas se centra en la imagen de la aglutinación de los pozos. </li></ol> 5. Interpretación de los resultados <ol><li> Identificación de pozos positivos y negativos. Comparar la prueba de aglutinación en las muestras con la de No hay control de virus y de anticuerpos (la precipitación de partículas de gelatina, no aglutinación) (Figura 1 y 2). Imágenes de aglutinación que se distingan claramente de ningún virus y sin control de anticuerpos (no de aglutinación, el control negativo) deben ser juzgadas como positivas, y las imágenes de aglutinación que son similares a los del control negativo debe ser juzgada como negativa. Ejemplos que muestran una clara aglutinación parcial, pero sólo podía ser juzgado como positivo, pero el registro como «positiva (aglutinación parcial). </li><li> Identificación de la energía fotovoltaica. Interpretar los resultados sobre la base de los pozos de positivo y negativo con anticuerpos anti-PV anticuerpos para identificar los serotipos PV. Principio de la interpretación del resultado es similar a la de la prueba de neutralización en el sistema de cultivo celular (por ejemplo positivo para anti-P1 +2 anticuerpos indica que la muestra contiene el tipo 3 PV). </li></ol> 6. Resultados representante Resultado representativo de la PA ensayo de identificación PV se muestra en la Figura 1. Todas las cepas PV formado aglutinación de partículas de gelatina sensibilizada (No existen anticuerpos de muestras). En presencia de los correspondientes anticuerpos anti-PV, la precipitación de partículas de gelatina (no aglutinación), similar a ningún virus y sin control de anticuerpos (control negativo) fue observada (por ejemplo, PV1 (Sabin) en la presencia de anticuerpos anti-P1 +2 o anti-P3 1 anticuerpos). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Identificación de la energía fotovoltaica mediante el ensayo de PA. Soluciones Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) y PV3 (Sabin) (títulos de virus de 1,2 x 10 8 CCID 50 / l 12, 8,2 x 10 7 CCID 50 / 12 l, y 3.5 x 10 7 CCID 50 / 12 l, respectivamente) fueron utilizados para la identificación mediante el ensayo de PA. No hay virus y sin control de anticuerpos mostraron la precipitación de partículas de gelatina (no de aglutinación, el control negativo). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Interpretación de los pozos de positivo y negativo. Soluciones Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) y PV3 (Sabin) (títulos de virus de 2,4 x 10 8 CCID 50 / 25 l, 1,7 x 10 8 l CCID 50 / 25, y 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 l, respectivamente) se diluye 1 / 20 a 1 / 320, y luego 25 l de las muestras diluidas fueron examinados por el ensayo de PA sin anti-PV anticuerpos.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Polio+Laboratory+Manual+%284th+edition%29+WHO%2FIVB%2F04.10%22">Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10</a>. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).</li>
<li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li>
<li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li>
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<li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li>
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<li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li>
<li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li>
<li>Avoort, H. G. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li>
<li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+group-%2C+serotype-%2C+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li>
</ol>

Souji Masujima es un empleado del Departamento de Diseño de Nuevos Productos, Fujirebio Inc.

El único punto de este ensayo PA es la utilización de la molécula de PVR en lugar de anticuerpos anti-PV para la detección de FV 2. Esto permite una interacción específica de las partículas sensibilizadas con gelatina de PV con una afinidad uniforme para los tres serotipos de la energía fotovoltaica 3-6. Se utilizó un formulario de inmunoadhesina de PVR (PVR-IgG2a) para la sensibilización de las partículas de gelatina, ya que las formas monoméricas de PVR sólo tienen afinidades moderada al sitio de unión simp...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Sensibilizados partículas de gelatina </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Kit de prueba </td></tr><tr><td> La reconstitución de amortiguación </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Kit de prueba </td></tr><tr><td> Microplacas </td><td> Fujirebio Inc. </td><td></td><td> Kit de prueba </td></tr><tr><td> Anti-PV anticuerpos </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

En la Iniciativa de Erradicación Mundial, el diagnóstico de laboratorio desempeña un papel fundamental mediante el aislamiento y la identificación de PV de las muestras de heces de parálisis flácida aguda (PFA). En la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Red de Laboratorios Mundial de la Poliomielitis, el aislamiento y la identificación PV están llevando a cabo mediante el sistema de cultivo celular y en tiempo real RT-PCR, respectivamente. En la era posterior a la erradicación de la energía fotovoltaica, los procedimientos de identificación simple y rápida sería de gran ayuda para la rápida confirmación de casos de polio en los laboratorios nacionales. En el presente estudio, vamos a mostrar el procedimiento de ensayo de la novela de PA desarrollado para la identificación de PV. Este ensayo PA utiliza la interacción de la energía fotovoltaica receptor (PVR) y el virión molécula que es la afinidad específica y uniforme para todos los serotipos de la energía fotovoltaica. El procedimiento es sencillo (un procedimiento de paso en las placas de reacción) y rápido (los resultados se pueden obtener dentro de las 2 h de reacción), y el resultado es visualmente observado (observación de la aglutinación de partículas de gelatina).

Una partícula desarrollado recientemente la novela de aglutinación (PA) de ensayo utilizando virus molécula del receptor permite una identificación rápida y fácil de poliovirus (PV). En este artículo vamos a mostrar el procedimiento para el ensayo de PA para la identificación de PV.

Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

En la Iniciativa Global para la Erradicación de la Poliomielitis, el diagnóstico de laboratorio desempeña un papel fundamental al aislar e identificar el PV a partir de muestras de heces de casos agudos...

El objetivo general del siguiente procedimiento es identificar rápidamente aislamientos de virus de la poliomielitis mediante un protocolo sencillo. Para este ensayo, utilizamos partículas de gelatina sensibilizadas recubiertas con moléculas quiméricas que contienen el dominio extracelular del receptor humano del virus de la poliomielitis unido al fragmento fc de IgG2. Dado que estas partículas tienen una afinidad uniforme por todos los serotipos de aislamientos del virus de la poliomielitis, se produce aglutinación de las partículas tras la incubación con muestras que contienen cualquier virus de la poliomielitis humano.Sin embargo, si están presentes anticuerpos capaces de reconocer el aislado viral específico de la muestra, ocurre la neutralización y se evita la aglutinación; mediante este sistema experimental, se puede realizar la identificación rápida de aislados de poliovirus en una sola reacción. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la prueba convencional de neutralización, es la simplicidad de la SIM en cuanto al procedimiento y a la interpretación, con el fin de reducir la mano de obra requerida y acortar el tiempo necesario para obten

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Investigación

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Immunology and Infection

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El genoma del virus de influenza A se compone de ocho complejos separados de ARN y proteínas, denominadas complejos de ribonucleoproteína viral (vRNPs). Este trabajo describe la purificación gradiente de glicerol y de microscopía electrónica de transmisión de visualización de la gripe A vRNPs.

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