Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

El objetivo general del siguiente procedimiento es identificar rápidamente un virus de la poliomielitis aislado utilizando un protocolo sencillo. Para este ensayo, utilizamos partículas de gelatina sensibilizadas recubiertas con moléculas quiméricas que contienen el dominio extracelular del receptor del poliovirus humano conectado a IgG dos fc. Dado que estas partículas tienen una afinidad uniforme por todos los serotipos de aislados de poliovirus, la aglutinación de las partículas se produce tras la incubación con muestras que contienen cualquier poliovirus humano.

Sin embargo, si están presentes anticuerpos capaces de reconocer el virus específico que aísla la muestra, se produce la neutralización y se evita la aglutinación mediante este sistema experimental, se puede realizar una identificación rápida de los aislados de poliovirus en una reacción de un solo paso. La principal ventaja de esta técnica de vaso existente, al igual que la prueba de neutralización convencional, es la simplicidad del procedimiento y la interpretación, con el objetivo de reducir el trabajo y agilizar y acortar el tiempo de obtención de resultados. Para reconstituir los anticuerpos anti PV uno, PV dos y PV tres, agregue 0,5 mililitros de agua a cada vial.

A continuación, transfiera cada solución de anticuerpos a tubos separados que contengan 4,5 mililitros de medios de mantenimiento. Algunos lotes de anticuerpos anti PV se proporcionan en forma reconstituida para dichos lotes de anticuerpos anti PV. No es necesario agregar agua para la reconstitución.

A continuación, prepare mezclas uno a uno de solución combinada de anticuerpos con un volumen final de 3,6 mililitros en tubos nuevos etiquetados. Por ejemplo, mezcle 1,8 mililitros de anti PV uno con 1,8 mililitros de anti PV dos. Para preparar una combinación de anti PV uno más PV dos, repita esto para cada combinación posible por pares y también prepare una solución que contenga los tres tipos de anticuerpos mezclando 1,2 mililitros de cada antisuero.

Una vez que se han realizado las cuatro mezclas a 720 microlitros de FCS a cada solución de anticuerpos. Esto ayudará a reducir la aglutinación inespecífica de las partículas de gelatina por los anticuerpos durante el ensayo. Los grupos de anticuerpos pueden almacenarse a menos 20 grados centígrados hasta que se utilicen en el ensayo de aglutinación.

En este ensayo, utilizamos partículas de gelatina liofilizada que han sido recubiertas con los dominios extracelulares del receptor del poliovirus humano e IgG dos dominios FC de ratón. Asegúrese de utilizar un solo lote de partículas y no diferentes lotes en un experimento para garantizar la consistencia de la imagen de aglutinación para reconstituir las partículas a 1,5 mililitros de tampón de reconstitución en cada vial. Golpee suavemente para mezclar bien.

Las partículas reconstituidas pueden almacenarse a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas. Primero, diseñe su experimento en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Para cada muestra, el pozo número uno contendrá solo el virus.

Los pozos del dos al cinco contendrán el virus más una de las cuatro soluciones de anticuerpos mixtos. Asegúrese de guardar un pozo para un control negativo que contenga medios solo sin virus ni anticuerpos. Una vez que se haya colocado la placa, agregue 12 microlitros de la solución de anticuerpos correcta a cada pocillo de las filas dos a cinco y 12 microlitros de crecimiento.

Medio para el virus solo, pozos en la fila uno, y para el pozo de control negativo en la fila seis. A continuación, agregue 12 microlitros de muestra de virus en las primeras cinco filas y 12 microlitros de medio de crecimiento al pocillo de control negativo en la fila seis. Una vez que los anticuerpos y el virus han sido colocados, resus, suspenda las partículas de gelatina reconstituidas golpeándolas suavemente y agregue inmediatamente 25 microlitros de partículas por pocillo a todos los pocillos.

Es importante no dejar que las partículas se asienten antes de transferirlas a la placa para obtener cantidades iguales de partículas en cada una. Bueno, coloque la placa de ensayo en un mezclador de placas y mezcle durante 30 segundos. A continuación, coloque la placa sobre una hoja de papel blanco e incube la placa a temperatura ambiente durante dos horas para permitir que se produzca una aglutinación.

Es importante no mover la placa en ningún momento durante o después de la incubación, ya que la aglutinación formada es inestable. Una vez que se haya producido la reacción, tome varias fotografías de la placa en las que se pueda apreciar la calidad de la aglutinación en cada pocillo. En los pozos donde no se ha producido la aglutinación, como se muestra aquí a la izquierda, las partículas de gelatina coloreadas precipitarán en el fondo del pozo en los pozos donde se ha producido la aglutinación.

Debido a la interacción entre el virus y el pvr, IgG dos partículas de gelatina recubiertas de A, se ve un patrón de color difuso como se muestra en el centro. En este experimento, probamos la capacidad de las soluciones virales, PV uno, dos y tres para inducir glu en presencia del anticuerpo. Las combinaciones indicadas como se muestra aquí en ausencia de virus o anticuerpos, no se produce aglutinación y las partículas de gelatina precipitan en contraste en virus bien contenedores, pero no anticuerpos.

Se ha producido aglutinación debido a la interacción del virus. Con las partículas de gelatina PVR IgG cubiertas de dos A en los pocillos experimentales, se evita un exceso de virus en cualquier pocillo que contenga anticuerpos que neutralicen específicamente ese virus. Por ejemplo, se evita un exceso de poliovirus de tipo uno en los pocillos que contienen anticuerpos anti PV uno, pero no en los pocillos que contienen sólo anticuerpos anti PV dos y anti PV tres.

Lo mismo ocurre con los tipos dos y tres del virus de la poliomielitis. Mientras se domina, esta técnica se puede realizar en tan solo tres horas si se realiza correctamente.