La formación específica de las vocalizaciones de ultrasonidos en las ratas viejas y Parkinson

El objetivo general de este procedimiento es entrenar a ratas para aumentar la cantidad y complejidad de sus vocalizaciones ultrasónicas, o US. Esto se logra primero grabando las vocalizaciones basales. El siguiente paso consiste en entrenar para lograr vocalizaciones específicas mediante refuerzo positivo.

Después del entrenamiento, se registran las vocalizaciones. El paso final del procedimiento es el análisis acústico y la comparación de las vocalizaciones basales frente a las postentrenamiento. Finalmente, se pueden obtener los resultados.

Ese entrenamiento aumenta el número y la complejidad de las vocalizaciones ultrasónicas mediante incrementos en parámetros acústicos como el ancho de banda, la frecuencia pico y la duración. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los trastornos de la comunicación, como la forma en que el ejercicio vocal modula los mecanismos neuronales subyacentes. Aunque este método puede proporcionar información sobre los déficits sensoriomotores craneales asociados con la enfermedad de Parkinson y el envejecimiento.

También puede aplicarse a otros modelos y condiciones de enfermedad que utilicen vocalizaciones ultrasónicas como un índice conductual. La demostración del entrenamiento en vocalización la realizarán Emerald Dahl y Jamie Shire, miembros de mi laboratorio. Para comenzar la monitorización ultrasónica, cargue el software Avisoft Recorder, seleccione permanente ilimitado en el disparador para permitir que las grabaciones se inicien y detengan manualmente. A continuación, designe la ubicación donde se guardarán los archivos de audio capturados en el directorio base.

La frecuencia de muestreo debe ser de al menos 200.000 hertzios para capturar la frecuencia más alta de vocalización. Una vez establecidos estos parámetros, retire la parte superior de la jaula domiciliaria del macho y colóquela directamente debajo del micrófono. A continuación, identifique una rata hembra sexualmente receptiva en celo por la presencia de lordosis, movimiento rápido de las orejas y desplazamientos rápidos y bruscos.

Coloque a la hembra receptiva en la jaula del macho objeto. Cuando el macho muestre interés por la hembra olfateándola, persiguiéndola o montándola, retire a la hembra y registre las vocalizaciones del macho durante uno o dos minutos. Monitoree visualmente las vocalizaciones ultrasónicas observando el espectrograma en tiempo real.

Si el macho no vocaliza, devuelva inmediatamente y brevemente a la rata hembra a la jaula domicilio del macho para estimular la vocalización. Para comenzar, lleve una sola rata macho al cuarto de entrenamiento. Todas las demás ratas macho deben mantenerse en una habitación contigua hasta su sesión de entrenamiento.

La rata debe tener acceso restringido al agua previamente para facilitar el uso del agua como recompensa. Durante el entrenamiento, configure la grabadora Avis soft como se mostró anteriormente. A continuación, coloque la jaula de alojamiento debajo del micrófono.

Una vez que el macho esté en posición, introduzca una rata hembra receptiva en la jaula. Retire a la hembra cuando el macho haya mostrado interés por ella y observe las vocalizaciones objetivo. Inicialmente, se recompensa cualquier llamada modulada en frecuencia de 50 kilohercios.

Presente la recompensa haciendo clic simultáneamente en un bolígrafo y mostrando brevemente una botella de agua o alimento. Trate como entrenamiento el progreso solo hacia cadenas de llamadas cada vez más complejas, como secuencias de cinco o 10 llamadas en rápida sucesión, que se refuerzan. Continúe el entrenamiento hasta que se hayan dado 30 refuerzos.

Esto normalmente tarda entre cinco y diez minutos en analizar las grabaciones de la línea base y posteriores al entrenamiento. Primero, genere un archivo de la grabación de sonido original y realice ediciones en una copia de trabajo para eliminar las frecuencias de ruido por debajo de las vocalizaciones ultrasónicas. Utilice el modo por lotes de AVI Soft SaaS Lab Pro para aplicar un filtro pasa-altos a los archivos de sonido a 25 kilohercios.

Para determinar el umbral de ruido necesario para utilizar la función de detección automática de elementos de SaaS Lab Pro, abra un archivo de sonido y cree un espectrograma. Establezca la longitud de la FFT en 512 con un tamaño de cuadro del 75 % y una superposición temporal del 93,75 %. Habilite la edición de forma de onda para que el ruido eliminado del espectrograma también pueda ser removido de la forma de onda. Configure las mediciones automáticas de parámetros como se muestra aquí.

Los tres parámetros que deben medirse son la duración del elemento, la frecuencia máxima y la amplitud máxima. En la ubicación de las mediciones, la sección permite la amplitud máxima y los parámetros mínimos y máximos de todo el elemento. En cuanto a la separación de elementos, seleccione umbral único automático y muestre el umbral.

Busque un área del espectrograma donde no haya llamados ni ruidos. Esto es el ruido de fondo. Ajuste el umbral ligeramente por encima del ruido de fondo.

Al ajustar la línea negra en la ventana del espectro de potencia situada encima del espectrograma, puede encontrarse aquí el nivel de decibelios del umbral establecido en el paso anterior. Establezca el valor de amplitud rechazada en un decibelio por debajo del umbral. Estos dos valores deben utilizarse ahora para todos los archivos de sonido analizados.

Suponiendo que todos los ajustes de grabación fueron iguales, para etiquetar las vocalizaciones, cree un espectrograma utilizando el umbral automático establecido previamente y la misma configuración mostrada anteriormente. Borre manualmente cualquier ruido que cumpla los siguientes criterios: uno, que haya sido identificado erróneamente como una vocalización; dos, que esté afectando la discriminación del inicio y/o final de la vocalización; tres, que haya sido identificado erróneamente como la frecuencia más alta o más baja en la vocalización, que están indicadas respectivamente por las líneas rojas superior e inferior.

En algunos casos, una vocalización no puede separarse del ruido circundante, como el sonido del lecho durante la locomoción. Esta llamada no puede analizarse con precisión y debe borrarse una vez que todas las vocalizaciones hayan sido identificadas; borre permanentemente las secciones eliminadas del espectrograma del archivo de sonido. Para ello, seleccione eliminar, borrar secciones del espectrograma de la forma de onda en el menú desplegable de herramientas para crear etiquetas permanentes en el archivo de sonido.

Abra la ventana de configuración de medición automática de parámetros y haga clic en el botón de edición en la sección de separación de elementos visual y oralmente. Revise cada vocalización etiquetada para determinar su categoría y asigne la etiqueta correspondiente utilizando los módulos de texto predefinidos. Las categorías que utilizamos en nuestro análisis son frecuencia simple, modulada y armónica.

Cierre el espectrograma, guarde el archivo de sonido y continúe con el siguiente archivo de sonido que se va a analizar. Después de que se hayan identificado las vocalizaciones en todos los archivos de sonido, utilice la herramienta de procesamiento por lotes para medir automáticamente los parámetros acústicos de todos los archivos. En el cuadro de diálogo de procesamiento por lotes, seleccione mediciones automáticas de parámetros en el menú desplegable.

Seleccione la casilla de verificación procesar todos los archivos en la carpeta seleccionada. Luego, haga clic en el botón carpeta y seleccione la carpeta donde se guardan los archivos de sonido. Haga clic en iniciar y cada archivo se analizará automáticamente según la configuración utilizada por última vez.

En el cuadro de diálogo de configuración de medición automática de parámetros, las mediciones se guardarán en un archivo de texto que puede definirse utilizando el comando de configuración de parámetros DDE seguido de la opción de archivo de registro. Este archivo de texto luego puede importarse a un programa para análisis estadístico. Estos gráficos demuestran que el número de vocalizaciones por sesión y la tasa de vocalizaciones por minuto aumentan ambos durante un período de entrenamiento de seis semanas.

Aquí se muestran, de izquierda a derecha, vocalizaciones representativas de cada una de las tres categorías de vocalizaciones de 50 kilohertz que utilizamos. Son de frecuencia simple, moduladas y armónicas. En este ejemplo, se muestran vocalizaciones moduladas en frecuencia del mismo ratón antes de la inducción del Parkinsonismo, tras la inducción del Parkinsonismo y después del entrenamiento en vocalización.

En comparación con la vocalización de referencia en el panel A, la vocalización en la condición de parkinsonismo en el panel B muestra una reducción en el ancho de banda, la duración y la intensidad. La vocalización posterior al entrenamiento mostrada en el panel C demuestra cómo la duración, la intensidad, el ancho de banda y la modulación de frecuencia regresan a los niveles basales tras el entrenamiento en vocalización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo entrenar, grabar y analizar las vocalizaciones ultrasónicas de las ratas.