La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

El objetivo general de este procedimiento es realizar una marcación dirigida de células renales en el riñón embrionario de pez cebra, el pronefros, con el fin de estudiar la regeneración epitelial renal tras una lesión renal aguda. Esto se logra primero mediante la microinyección de embriones de pez cebra con un conjugado fluorescente de dextrana. Durante una incubación nocturna, los conjugados son absorbidos selectivamente por las células del túbulo proximal del nefrón.

Al día siguiente, las células se examinan mediante fluorescencia epiluminiscente y se ablacionan células seleccionadas utilizando un sistema de láser pulsado. Posteriormente, se evalúan los cambios morfológicos y moleculares mediante histología, hibridación en montaje completo C y inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la lesión aguda del riñón inducida por el antibiótico nefrotóxico gentamicina, es que tales tratamientos provocan daños catastróficos y son letales, impidiendo el análisis de los eventos de regeneración renal a lo largo del tiempo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del riñón, como la identificación de eventos de señalización molecular que ocurren durante la regeneración epitelial. Tuvimos por primera vez la idea de esta técnica cuando deseábamos desarrollar un análisis detallado de la regeneración epitelial renal en placas de Petri. Recolecte embriones de pez cebra fertilizados en solución E tres modificada sin azul de metileno.

Eleve los embriones fertilizados a 28,5 grados Celsius hasta que tengan entre 48 y 55 horas posteriores a la fertilización, momento en el que el sistema renal del embrión ya ha comenzado a funcionar. Antes de iniciar las inyecciones, prepare un soporte para inyecciones de aros utilizando un molde con depresiones triangulares para sostener los embriones. A continuación, prepare agujas de microinyección estándar y una solución de inyección para etiquetar el túbulo proximal. Comience el experimento preparando los embriones.

Primero, retire el corion de los huevos no eclosionados utilizando pinzas finas. Luego, enjuague los restos de corion, los restos del recipiente de Petri y rellene el recipiente con 30 mililitros de solución E tres modificada. Segundo, anestesie las larvas con cinco mililitros de trica.

Asegúrese de que las larvas estén completamente anestesiadas verificando la respuesta al tacto. Si no están completamente anestesiadas, se estremecerán durante la inyección. En tercer lugar, utilizando una pipeta de transferencia de plástico, coloque las larvas en el molde.

Coloque los animales con sus cabezas en la parte más profunda de la depresión y sus troncos a lo largo del costado del pocillo. Proceda ahora con microinyecciones intramusculares cargando una aguja preparada con dos o tres microlitros de dextrano marcado con fluoresceína, coloque la aguja e inyecte aproximadamente un nanolitro de solución en el tronco de cada animal. Los conjugados de dextrano son fácilmente endocitados por el túbulo proximal del nefrón, lo que permite la marcación preferencial de esta población de células epiteliales.

Apunte a la porción superior del conducto y evite la extensión del saco vitelino, ya que de lo contrario los túbulos nefrónicos terminarán dañados, como en este animal inyectado incorrectamente. Una vez inyectadas las larvas, transfiéralas a una placa de Petri limpia y enjuáguelas tres veces con medio E tres fresco para eliminar todos los rastros de trica. A continuación, cubra la tapa con papel de aluminio e incube los animales durante la noche a 28 grados Celsius.

Antes de comenzar este procedimiento, prepare el medio de inmovilización y conserve algunas alícuotas para su uso inmediato a temperatura ambiente, y guarde las alícuotas restantes a cuatro grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. Comience anestesiando las larvas de pez cebra con cinco mililitros de trica en 30 mililitros de E tres. Al igual que antes, asegúrese de que los peces no respondan a la sensación táctil.

Ahora examine los animales inyectados bajo fluorescencia para seleccionar larvas con túbulos proximales fácilmente visualizables. Transfiera hasta 12 larvas a un nuevo recipiente que contenga la misma concentración de trica en un microscopio fluorescente compuesto equipado con un filtro fitzy, iluminación de campo claro y un láser. La ablación comienza transfiriendo y anestesiando la larva a un recipiente que contiene medio de inmovilización.

Y espere dos minutos, luego transfiera la lava a un portaobjetos con cavidad que contenga una gota de medio de inmovilización. Coloque suavemente el animal con el lado dorsal hacia arriba utilizando una sonda fina y enfoque el lado dorsal. Ahora, utilizando un sistema láser pulsado calibrado con micro punta, ablate uno de los nefrones dejando el otro intacto como control.

Verá la dispersión de la fluorescencia a medida que se ablacionan las células epiteliales renales. Luego, transfiera suavemente el animal a un pocillo de una placa de 12 pocillos y enjuáguelo tres veces en medio E tres para eliminar la metilcelulosa. Continúe ablacionando nefrones hasta que se llene la primera placa de 12 pocillos.

Luego anestesie otros 12 animales y repita el proceso. Se inyectó Dextra Fitzy para etiquetar preferentemente el túbulo proximal. A los tres días post fertilización, se ablacionó con láser el nefrón de cada animal.

Un día después de la ablación. La regeneración no es evidente cuatro días después de la ablación, sin embargo, la regeneración ha ocurrido tras la ablación celular *in situ* dos. Se utilizó hibridación para analizar los cambios en muestras fijadas en puntos temporales individuales.

Este embrión no fue sometido a ablación. En contraste, en este embrión se ablató un extenso segmento del epitelio tubárico, y en este otro se ablató un tramo corto del epitelio tubular. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la hibridación in situ en preparaciones completas para responder preguntas adicionales, como la identidad de los cambios en la expresión génica durante el proceso de regeneración del nefrón.

No olvide que trabajar con productos químicos puede ser extremadamente peligroso. Se recomiendan precauciones, como el uso de equipo de protección personal, por ejemplo una bata de laboratorio y guantes, durante este procedimiento.