Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

El objetivo general del siguiente experimento es registrar los eventos subcelulares durante la embriogénesis temprana. Esto se logra mediante el uso de cepas transgénicas con múltiples proteínas marcadas con fluorescencia que permiten la visualización del ADN, así como de subconjuntos de vesículas. En el embrión temprano, orgánulos específicos se marcan mediante una microinyección de tintes fluorescentes, como el rastreador Lyo o el rastreador MIT, en la gónada del gusano adulto. A continuación, los embriones se extraen de gusanos adultos y se observan con un microscopio confocal para obtener registros de lapso de tiempo de los movimientos de las proteínas marcadas en los orgánulos.

En última instancia, el protocolo revela un movimiento interesante de los lisosomas y las vesículas marcadas con GFP durante el desarrollo temprano en los alérgenos CL. Mi nombre es Connie Hedger, y hoy les mostraré cómo realizamos la microscopía de lapso de tiempo en nuestro laboratorio, el laboratorio Boyd de la Universidad de Alabama en Huntsville. Para este experimento, los gronematodos se colocaron en placas de NGM agri, colocadas con un césped bacteriano OP 50 a 25 grados centígrados el día anterior al experimento, recogieron al menos 40 L de cuatro larvas en placas sentadas y las incubaron durante la noche a 25 grados centígrados.

Estos gusanos serán adultos jóvenes. Para el experimento. Haga una almohadilla de inyección intercalando, dos gotas de 2%aros en agua de una pipeta pasada entre dos cubreobjetos de vidrio, y aplicando presión para dar forma a los agros en un círculo de 1,5 centímetros de diámetro.

Retire el cubreobjetos superior y deshidrate la almohadilla colocándola en un horno a 80 grados centígrados durante una hora, o déjela reposar en la mesa de trabajo durante la noche. El día de la inyección, prepare una solución de tinte diluida MIT tracker o lyo tracker y extraiga las agujas de inyección de un capilar de vidrio de 1,2 od. Rellene las agujas con una solución de tinte diluida y guárdelas en una aguja de inyección de montaje en cámara humidificada oscura en el micromanipulador y conecte la aguja a un regulador de presión con un tubo de 1,2 milímetros de diámetro interno.

Ahora coloque dos gotas de aceite mineral pesado en la almohadilla de inyección. Coloque la almohadilla de inyección en el microscopio y baje la aguja en el aceite. Aplique presión de inyección y observe si el líquido sale de la aguja.

De lo contrario, deberá romper suavemente el extremo de la aguja introduciendo suavemente la punta en un pequeño trozo de cubreobjetos roto colocado en la almohadilla de inyección. Después de que la aguja esté fluyendo, proceda con la inyección una hora antes de ver los embriones. Use una imagen para transferir gusanos adultos jóvenes a la gota de aceite en la almohadilla de inyección.

Coloque de tres a 10 lombrices en paralelo y a una distancia de un poco menos de una lombricín. Ahora es importante inyectar los gusanos rápidamente antes de que se sequen. Mueva la almohadilla con gusanos a la platina del microscopio.

Concéntrese en la parte central de la gónada distal. A continuación, utilice el micromanipulador para mover la punta de la aguja al mismo plano focal. Perfora el gusano moviendo la platina horizontalmente.

Cuando la punta de la aguja esté dentro del cubo, aplique presión para llenar la gónada con la mezcla de tinte. La gónada se expandirá con el volumen de la inyección. Proceda con la inyección.

Ambos van brazos netos de cada gusano después de la inyección. Cubra los gusanos con 0,5 mililitros de tampón de huevo aplicado. Con una pipeta de pasto tirado, deje que las lombrices se recuperen durante una o dos horas a temperatura ambiente en una cámara humidificada sin luz.

Comience preparando una nueva almohadilla agros para ver los embriones inyectados con una pipeta pasada. Coloque tres gotas de agros fundidos en un portaobjetos de microscopio limpio y coloque ese portaobjetos entre otros dos portaobjetos envueltos en una capa de etiquetado. Cinta adhesiva: la cinta controla el grosor de la almohadilla.

A continuación, presione el deslizador de microscopio limpio hacia abajo sobre las gotas de agros para que descanse sobre los portaobjetos de cinta. No retire el portaobjetos superior hasta que los embriones estén listos para montar. Ahora deje caer 20 microlitros de tampón de huevo en el centro de un cubreobjetos y transfiera los gusanos inyectados al tampón Bajo un microscopio de disección, corte los gusanos cerca de la vulva.

Usando una aguja hipodérmica de calibre 26, los embriones se derramarán fuera del gusano. Ahora retire el portaobjetos superior del portaobjetos de imagen y baje la almohadilla aros boca abajo sobre el cubreobjetos con los embriones. Si se van a obtener imágenes de los embriones durante un período prolongado de tiempo, selle los bordes del cubreobjetos con vaselina para evitar la desecación.

Ahora, comience a obtener imágenes localizando embriones bajo el objetivo 10 x para encontrar embriones en etapa temprana, busque embriones que estén en proceso de completar la meiosis materna. Los embriones mióticos se pueden distinguir de los embriones posteriores porque no han sufrido un acortamiento. Después de completar la meiosis, hay un espacio significativo entre la membrana celular y la cáscara del huevo en el extremo anterior del embrión.

Una vez que se identifica un embrión en la etapa adecuada, se pasa a una lente de aumento más alta para registrar la embriogénesis. Este embrión expresa las proteínas marcadas con ubiquitina M cherry, histona dos B y GFP. El ADN materno y paterno es visible a través de la cereza M H dos B, y por lo tanto muestra las etapas del desarrollo temprano.

Este embrión fue inyectado con OC Tracker blue y expresa GFP Ubiquitina. Las imágenes se recogieron utilizando una lente NA de 63 x 1,4 con 4 láseres 88 y 5 55 ajustados a mínima potencia y máxima ganancia. Por lo general, los Zacks se recolectan cada 10 a 15 segundos durante un máximo de 60 puntos de tiempo antes de que ocurra el fotoblanqueo.

Para este video TimeLapse, las pilas Z se colapsaron en imágenes de proyección máxima mientras se realizaba un lapso de tiempo. Los embriones de microscopía deben comenzar la migración pronuclear a los pocos minutos de completar la miosis dos, y dentro de los 20 minutos. Debe comenzar la primera citocinesia.

Si observa un desarrollo detenido de sus embriones, intente disminuir la intensidad del láser o use una almohadilla de calibre augurio más gruesa.