Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton

Los microbios median la degradación de numerosos sustratos de carbono orgánico disuelto o compuestos de COD, como en ambientes terrestres y acuáticos. Para comprender completamente el papel de los microbios en la transformación del COD, es necesario identificar simultáneamente su taxonomía y función. Este video demuestra un procedimiento para la identificación taxonómica de bacterias de vida libre o bacterias planctónicas que transforman grupos específicos de COD y ambientes acuáticos.

Las muestras de agua recolectadas de un ambiente de prueba se procesan e incuban con un compuesto de interés y bromodesoxiuridina, BRDU, que se incorpora al ADN recién sintetizado y a las células en crecimiento activo. A continuación, el plancton bacteriano marcado con BRDU se etiqueta con anticuerpos anti-BRDU conjugados con ZI. El plancton bacteriano con altos niveles de marcado con BRDU se aísla mediante clasificación celular activada por fluorescencia.

El ADN se extrae luego de las células ordenadas y se realiza la identificación taxonómica basándose en los resultados del análisis del gen del ARN ribosómico 16 s mediante PCR. Hola, mi nombre es Steven Robbins del laboratorio de la Dra. Chen Mao en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Kent. Hoy, lu y yo les mostraremos un método independiente de cultivo para la identificación de bacterias planctónicas degradadoras de DOC en ambientes acuáticos.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la adición de nutrientes, seguida de análisis del ADN de la comunidad bacteriana, es que centra el análisis en bacterias altamente activas y excluye células inactivas y de crecimiento lento. Aquí mostramos la identificación de bacterias del plátano que utilizan un compuesto específico de DOC. Sin embargo, este método también puede aplicarse para estudiar el plancton bacteriano que utiliza otro compuesto individual de DOC o grupos de DLC, como los exudados de algas.

Entonces, obtengamos algunas muestras de agua y comencemos. Antes de analizar las muestras de agua para detectar bacterias planctónicas que degradan el DOC, las muestras de agua deben procesarse adecuadamente. Las muestras mostradas aquí se recolectaron de la costa de Georgia para eliminar partículas grandes y ER VREs de la muestra de agua.

Utilice una bomba peristáltica para transferir agua desde el matraz de recolección a una unidad de filtración con un filtro de tamaño de poro de un micrómetro. A continuación, transfiera alícuotas de 36 mililitros del filtrado a tres tubos estériles de polipropileno de 50 mililitros. Cada uno conteniendo cuatro mililitros de solución de paraformaldehído al 10% recién preparada. Incube durante dos horas a temperatura ambiente para preservar las células tras la incubación.

Vierta el agua en la torre de filtración de una unidad de filtración al vacío de vidrio con filtros de membrana blanca de 0,22 micrómetros de tamaño de poro y aplique vacío para hacer pasar la solución a través del filtro. Lave el filtro aplicando 10 mililitros de PBS a través del filtro al vacío. Etiquete los filtros como controles negativos y almacénelos a menos 20 grados Celsius.

Para establecer un ecosistema experimental o microcosmos, comience llenando seis frascos de vidrio de un litro, previamente enjuagados, con 800 mililitros de la muestra de agua previamente filtrada. Añada BRDU a cada microcosmos hasta alcanzar una concentración final de 10 micromolar. Gire rápidamente el frasco manualmente para mezclar.

Se analizará cada muestra por triplicado. Por lo tanto, añada el compuesto modelo de DOC a tres de los microcosmos. Aquí se añade reina a los microcosmos a una concentración final de 100 nanomolares.

Luego, a los otros tres microcosmos añada PBS estéril. Estos servirán como controles sin DOC. Coloque todos los microcosmos en un incubador con agitación a 100 RPM, en oscuridad y a la temperatura in situ, que es de 25 grados Celsius. En este punto, tome muestras a las 0, 8, 16 y 24 horas.

Recolecte 36 mililitros de cada microcosmos en un tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros que contenga cuatro mililitros de paraformaldehído fresco al 10%, incube durante dos horas a temperatura ambiente para fijar las células. A continuación, filtre las células fijadas a través de filtros de membrana blanca con un tamaño de poro de 0,22 micrómetros. Aplique 10 mililitros de PBS mediante filtración al vacío para eliminar los residuos de PFA.

Proceda inmediatamente a la detección inmunológica in situ INS o almacene los filtros a menos 20 grados Celsius para analizar la incorporación de BRDU en el plancton bacteriano. Comience colocando los filtros de muestra a temperatura ambiente para debilitar la pared celular bacteriana. Coloque el filtro en una unidad de filtración, luego pipetee un mililitro de solución de lisozima sobre el filtro para cubrir las células e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Tras la incubación, aplique vacío para eliminar la solución. Una vez que la solución atraviese el filtro, lave las células añadiendo 10 mililitros de PBS y aplique vacío. Luego, para dañar aún más la pared celular, añada un mililitro de solución de proteinasa K al filtro para cubrir las células.

Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar con PBS para obtener ADN de una sola hebra. Añadir un mililitro de solución de exonucleasa para cubrir las células en el filtro.

Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Tras la incubación, lavar el filtro pasando 10 mililitros de PBS a través del filtro al vacío. A continuación, recortar los bordes del filtro para eliminar la porción que no tiene células.

Luego, sobre una superficie seca limpia con alcohol, utilice una hoja estéril para cortar el filtro en ocho trozos de tamaño igual. Se necesitan ocho cámaras de incubación con sello de marco; coloque un octavo del filtro en cada cámara de incubación con sello de marco, con el lado de la muestra hacia arriba. Una vez ensambladas las cámaras, utilice el reactivo del kit de proliferación celular Roche Intu para detectar células marcadas con A-B-R-D-U in situ.

Una vez que finalicen los procedimientos de incubación, retire la sección del filtro de la cámara de incubación y colóquela sobre una superficie estéril; utilizando una hoja estéril, corte la sección del filtro en trozos pequeños. Transfiera los trozos de filtro a un tubo microcentrífugo de dos mililitros que contenga un mililitro de PBS, cierre herméticamente el tubo y séllelo con parafina. A continuación, incube el tubo en un agitador-incubadora a 37 grados Celsius y 200 RPM durante 10 minutos.

Tras la incubación, asegure el tubo y vortexéelo a velocidad máxima. Durante cinco minutos, aspire el sobrenadante SUP y transfiéralo a un tubo estéril de polipropileno de 15 mililitros. Luego, re suspenda el filtro en PBS y repita los pasos de vortex y incubación dos veces más, añadiendo cada vez el snat al mismo tubo de 15 mililitros para cada muestra.

Almacene las células resuspendidas a cuatro grados Celsius. La muestra debe analizarse mediante fax dentro de los dos días. Finalmente, separe las células para obtener la población con alto nivel de incorporación de BRDU.

Aquí se utiliza un citómetro de flujo de área BD fax y el software correspondiente. Una vez que las células han sido ordenadas, la población enriquecida con BRDU puede ser analizada para determinar su identidad taxonómica. Para amplificar los genes de ARN ribosómico 16 s de bacterias, se realizan PCR en filtro; pipetee las células ordenadas sobre un filtro de membrana de policarbonato blanco con un tamaño de poro de 0,22 y encienda la bomba de vacío; usando una cuchilla estéril, recorte los bordes libres de células del filtro.

Corte el filtro en cuatro trozos de tamaño igual para cada condición, coloque un solo trozo de filtro en cada uno de tres tubos de reacción PCR con las células orientadas hacia el interior del tubo. Añada 45 microlitros de agua de grado PCR. Deje que la sección del filtro se sumerja completamente en el agua.

A continuación, agregue dos perlas Roche illustra pure T ready to go PCR y vortexee brevemente para ayudar a disolver las perlas. Luego, añada dos microlitros de cada cebador, sentido directo y sentido inverso, del gen del ARN ribosómico 16 s.

Agregue un microlitro de BSA para ayudar a absorber los inhibidores de la amplificación o un microlitro de agua. Realice la amplificación por PCR en un termociclador. Se recomienda un programa de PCR con temperatura decreciente, en el cual la temperatura de hibridación disminuye secuencialmente de 62 a 52 grados Celsius en un grado Celsius por ciclo, seguido de 15 ciclos a 52 grados Celsius.

Confirme la amplificación por PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio, excave los amplicones de PCR del gel y purifíquelos con un kit rápido de extracción de geles KaiGen cayo. Tras la purificación de los amplicones de PCR en gel, reúna los amplicones del mismo muestra. Los amplicones purificados de ADN ribosómico 16 s ya están listos para diversas análisis moleculares.

Las muestras se recolectaron de un sitio costero de Georgia y se procesaron para estudiar bacterias degradadoras de racina siguiendo los procedimientos descritos en este video. La racina es un compuesto de poliamora que puede encontrarse ampliamente en ambientes marinos. Puede servir como fuente de nutrientes y energía para bacterias marinas, como se muestra aquí.

El análisis de hechos de las muestras reveló que, tras una incubación de 24 horas, se desarrolló un grupo de bacterias con un mayor nivel de intensidad de fluorescencia de FXI, que estaba positivamente relacionado con el grado de incorporación de BRDU, en microcosmos enriquecidos con Racine. Estas células fueron designadas como células con alta incorporación de BRDU o HI y se esperaba que contuvieran principalmente bacterias degradadoras de Racine. No hi.

Se encontraron células en los controles sin adición, que solo contenían células con niveles más bajos de incorporación de BRDU, denominadas células lii, las cuales se esperaba que contuvieran principalmente bacterioplancton que no fue capaz de utilizar. Las células Racine HI añadidas fueron clasificadas en tubos separados y luego recolectadas sobre filtros de membrana. Se obtuvieron amplicones parciales del gen del ARN ribosómico 16S tras la PCR del filtro y se confirmaron mediante electroforesis en gel.

Tras el filtro de clasificación, también se puede realizar la amplificación por PCR de genes funcionales para examinar la diversidad funcional entre las células clasificadas. Acabamos de mostrarle cómo separar e identificar físicamente células bacterianas funcionales en un ambiente acuático utilizando un enfoque que combina la clasificación fluorescente de células activadas y la incorporación de BRDU. Recuerde, BIDU es cabeza, tierra, un laboratorio y una bata; siempre se deben usar una bata de laboratorio y guantes al realizar este procedimiento.

Así es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.