Name: Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Aprende a identificar bacterioplancton degradador de carbono orgánico disuelto mediante etiquetado con BrdU y clasificación por citometría de flujo. Este método permite aislar células activas para estudios de ecología microbiana.

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La financiación de este proyecto fue proporcionado por la National Science subvenciones OCE1029607 Foundation (XM) y MCB0702125 (de MAM) y Gordon y Betty Moore Foundation (de MAM).

1. Procesamiento de las muestras de agua <ol><li> Filtro de 10 litros de agua del medio ambiente a través de un filtro de membrana micras de tamaño de poro para eliminar las partículas grandes y bacteriovores. Recoger el filtrado de agua en una garrafa. </li><li> Transferencia de 36 ml de filtrado a cada uno en tres tubos estériles Eppendorf (50 ml) contiene 4 ml solución preparada recientemente paraformaldehído (PFA, el 10%). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente para preservar las células. Recoger las células en 0,22 micras de tamaño de poro de filtros de membrana blanco por filtración al vacío. Lave el filtro de paso de 10 ml de buffer fosfato salino (PBS) a través del filtro por filtración al vacío. Etiqueta de los filtros como controles negativos y almacenarlos a -20 ° C. </li></ol> Pasos 1.3-1.4 son opcionales para el establecimiento de DOC-limitada condiciones. <ol start="3"><li> Añadir una mezcla de nitrógeno y fósforo inorgánico (5 mM NH 4 Cl, 5 M NaNO 3, y 1μM NaH 2 PO 4 concentración final) en la bombona. </li><li> Incubar en la oscuridad a la temperatura in situ durante 48 horas con agitación ocasional. </li></ol> 2. Microcosmos y el establecimiento de incubación <ol><li> Llene cada uno de los seis frascos de vidrio de 1 L con 800 ml de muestra de agua de la bombona de paso de 1,4 a establecer microcosmos. Añadir BrdU (10 mM, concentración final) en cada microcosmos. Mezclar bien. </li><li> Agregar un modelo DOC ml solución compuesta en tres de los microcosmos, estos servirán como enmiendas DOC. Añadir 1 ml de PBS estéril en los tres restantes microcosmos, estos servirán como controles sin adición. </li><li> Incubar todos los microcosmos en un agitador incubadora y se incuban en la oscuridad a la temperatura in situ mientras se agita a 100 rpm. </li><li> Recoger 36 ml de muestra de agua de cada microcosmos y la transferencia en tubos de 50 ml estériles Eppendorf en los puntos de tiempo de 0, 8, 16 y 24 horas. Inmediatamente añadir 4 ml de agua dulce PFA (10%) de los tubos de recolección y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente para preservar las células. </li><li> Filtro conservan las células a través de 0,22 micras de tamaño de poro de filtros de membrana de policarbonato. Lavar los filtros con 10 ml de PBS. Proceder de inmediato a la etapa siguiente o almacenar los filtros a -20 ° C. </li></ol> 3. En la inmunodetección situ para la incorporación de BrdU <ol><li> Descongele los filtros (DOC modificado muestras, los controles no-además de controles positivos y negativos) a temperatura ambiente. </li><li> Aplicar 1 ml de solución de lisozima [10 mg / ml de lisozima de clara de huevo en 100 mM Tris, 50 mM EDTA (pH = 8)] 4 para cubrir las células bacterianas en el filtro. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave el filtro pasando 10 ml de PBS a través de ella, bajo succión. </li><li> Añadir 1 ml de solución de proteinasa K [2 mg / ml de proteinasa K en 100 mM Tris, 50 mM EDTA (pH = 8)] 4 para cubrir las células bacterianas en el filtro. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lave el filtro pasando 10 ml de PBS a través de ella, bajo succión. </li><li> Añadir una solución de exonucleasa ml [exonucleasa III (50 U / ml) en 5 mM de MgCl2 y 50 mM Tris-HCl] 5 para cubrir las células bacterianas en el filtro. Se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. Lave el filtro pasando 10 ml de PBS a través de ella, bajo succión. </li><li> Montar el sello marco cámaras de incubación (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante. </li><li> Cortar el filtro en octavos con una cuchilla estéril sobre un alcohol limpiar la superficie seca. </li><li> Con unas pinzas, coloque una sección octava de un filtro en una cámara montada incubación marco de sellado (sello ocho marco cámaras se necesitan para cada muestra de filtro). El lado de la sección de filtro que contiene las células deben estar hacia arriba. La humedad en la parte posterior del filtro permite filtrar el palo a la diapositiva. Si el filtro se vuelve seca, aplicar una pequeña gota (2 l) del DIH 2 O en el centro de la cámara antes de colocar la sección de filtro en la diapositiva. </li></ol> Pasos 3.8-3.20 usar los reactivos del kit de Roche en la proliferación celular in situ, siguiendo los procedimientos Fluos modificado a partir de las instrucciones del fabricante. A excepción de PBS, todos los reactivos se proporcionan en el kit. <ol start="8"><li> Aplicar tampón de incubación suficiente (0,5% albúmina de suero bovino, 0,1% de Tween 20 en PBS), para cubrir uniformemente toda la sección de filtro en la cámara de incubación sin causar desbordamiento de una vez que el sello se aplica. </li><li> Coloque una cubierta de poliéster marco sobre el marco de la cámara de incubación. Presione hacia abajo para sellar herméticamente la cámara de incubación. Evite las burbujas de aire sobre el filtro. Se incuban las cámaras selladas durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Retire el sello de poliéster y abrir las cámaras de incubación. (Nota: la apertura de las cámaras a veces se tire hacia arriba el sello marco de la diapositiva En ese caso, prepare una nueva cámara para los siguientes pasos..) </li><li> Pipeta el tampón de incubación de una esquina de la cámara. Evite el contacto con el filtro. </li><li> Lave el filtro con cuidado pipeteando 100 l de PBS yfuera de la cámara de 3 veces. </li><li> Prepare anti-BrdU-Fluos solución de trabajo siguiendo los pasos recomendados por el fabricante inmediatamente antes del uso. </li><li> Pipetear 120 l anti-BrdU-Fluos solución de trabajo en el filtro, teniendo cuidado de cubrir uniformemente toda la superficie. </li><li> Cerrar de nuevo la cámara con una cubierta de poliéster nuevo. Evite las burbujas de aire en la parte superior del filtro. Incubar la cámara en la oscuridad a 37 ° C durante 3 horas. Este paso se etiqueta BrdU incorporado ADN in situ con isotiocianato de fluoresceína (FITC). </li><li> Quite la cubierta de poliéster y abrir la cámara de incubación. Pipeta la solución anti-BrdU-Fluos de trabajo. Lave el filtro 3 veces con PBS. </li><li> Transferir el filtro de la cámara de incubación a una superficie estéril. Cortar la sección de filtro en pequeños trozos con una cuchilla estéril. </li><li> Transferencia de las piezas de filtro en dos tubos de microcentrífuga ml, conteniendo cada uno 1 ml de PBS. Bien tapar el tubo y sellar con parafilm. Se incuba a 37 ° C y 200 rpm durante 10 minutos. </li><li> Asegurar los tubos en un vórtice y agitar a la velocidad máxima durante 5 minutos. Pipeta el sobrenadante a un tubo estéril de 15 ml Eppendorf. Repita los pasos de incubación y vortex durante 5 veces más. Combine el sobrenadante en el mismo tubo de 15 ml Eppendorf para cada muestra. Por lo general, el 80% de las células se pueden recuperar en la suspensión. </li><li> Guardar el sobrenadante con las células se resuspendieron a 4 ° C. Ordenar dentro de 2 días. </li></ol> 4. FACS análisis Un procedimiento de un citómetro de flujo BD FACSAria y el software correspondiente que se describe aquí. <ol><li> Optimizar el ajuste de los siguientes pasos del citómetro de flujo recomendado por el fabricante. Esto implica: ajustar el control de la amplificación para establecer los parámetros necesarios breakoff y el punto dulce, optimizar el retardo de láser y los factores de escala para la zona de presión de funda experimentar y optimizar la configuración de FSC y SSC tensión, el umbral de FSC, FSC escala de fluorescencia, fluorescencia voltajes PMT , etc </li><li> Ejecutar las muestras de control negativo en el citómetro de flujo (FCM) en base a la intensidad de fluorescencia de dispersión FITC y lateral (SSC). Aumentar el umbral de FITC hasta que no las células en los controles negativos se pueden visualizar por la pantalla de adquisición de FITC-SSC. </li><li> Además de ejecutar sin las muestras de control y examinar el patrón de distribución de 10.000 células sobre la base de FITC y la adquisición de cooperación Sur-Sur. Definir una puerta para incluir todas las células y designarlos como "células de baja intensidad" (LI). </li><li> Ejecutar DOC-modificado muestras y examinar el patrón de distribución de 10.000 células sobre la base de FITC y cooperación Sur-Sur. Algunas células se publicará en el preset puerta LI. Definir otra puerta para encerrar las células que tienen una mayor intensidad de fluorescencia (HIS) de Lis. Adquirir las estadísticas para ver la abundancia relativa de células cerradas. </li><li> Ordenar HI células en tubos de colección que contiene 500 l de PBS a "purificar una gota" de modo. Terminar la clasificación, cuando el número de su cuenta llega a 500.000. </li></ol> 5. Filtro de amplificación por PCR de los genes ARNr 16S Filtro de procedimientos de PCR se han modificado desde Kirchman et al 6. <ol><li> Filtro de células seleccionadas en un fondo blanco, 0,22 m de tamaño de poro, 25 mm de diámetro, filtro de membrana de policarbonato. Recorte el borde del filtro que no contiene células bacterianas usando una cuchilla estéril. Cortar el filtro en 8 trozos de igual tamaño. </li><li> Lugar de una sola pieza de filtro en un tubo de reacción de PCR, con las células hacia adentro del tubo. Añadir 45 l de agua grado PCR en el tubo de reacción de PCR. Sumergir el filtro en su totalidad en el agua. </li><li> Añadir 2 ROCHE ilustración PuReTaq Lea-To-Go bolas de PCR en el tubo de reacción de PCR, agitar brevemente. Añadir 2 l cada uno de los de avance y retroceso gen 16S rRNA primers (0,4 mM concentración final de cada cebador), tales como 27F y 1492R 7, en cada uno de los tubos de reacción de PCR. </li><li> (Opcional) Agregue 1μl solución de albúmina sérica bovina (BSA, la concentración final es 30μg/100 l) a la mezcla de reacción de PCR para ayudar a absorber los inhibidores de la amplificación. Si se opta por no añadir BSA, añadir 1μl de agua en su lugar. </li><li> Realizar la amplificación por PCR en un termociclador. Un toque por programa de PCR se recomienda, que tiene la temperatura de hibridación secuencial disminuye 62 a 52 ° C por 1 ° C por ciclo durante 11 ciclos, seguido de 15 ciclos con temperatura de anillamiento de 52 ° C. Todos los ciclos incluyen desnaturalización (95 ° C), hibridación (a los 62 a 52 ° C), y la extensión (a 72 ° C) los pasos de la duración de los años 50. Una inicial de 3 min de desnaturalización y final de 10 min de extensión paso también se incluye en el programa de PCR. </li><li> Confirmar la amplificación de PCR por electroforesis en un teñido con bromuro de etidio 1% en gel de agarosa. Los impuestos especiales los amplicones de PCR en el gel y la limpieza con el kit de QIAGEN QIAquick extracción de gel. </li><li> Realizar dos ampliaciones adicionales de PCR para cada muestra, cada vez que utiliza una sección de filtro. Después de PCR en gel Purificatide, la piscina amplificados de la misma muestra en conjunto. Purificada 16S ADNr amplificados ya están listos para una serie de análisis moleculares que permiten la identificación taxonómica, como la construcción de la biblioteca y la secuencia de clon. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Los resultados representativos se describen mediante un estudio de putrescina-bacterias degradantes como un ejemplo. Tomaron muestras de agua de una zona costera de Georgia y procesadas siguiendo los procedimientos descritos anteriormente. FACS análisis reveló que además de putrescina provocados por el desarrollo de un grupo de bacterias con alta intensidad de fluorescencia FITC, lo que indica la alta tasa de incorporación de BrdU (Figura 1). Estas células fueron designados como las células de alta BrdU incorporación (HIS) y se esperaba que contienen en su mayoría putrescina-degradantes bacterias. Su faltaban en los controles además de no-, que sólo contenía células con bajos niveles de incorporación de BrdU (LI). LI se esperaba que contienen principalmente bacterioplancton que no podían utilizar la putrescina añadió. Su fueron ordenados en tubos separados y recogidos en los filtros de membrana. 16S rRNA amplificados del gen se obtuvieron de células de alta HI con filtro de PCR. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Análisis de citometría de flujo sin adición de control y modelo compuesto modificado (putrescina como un ejemplo aquí) las muestras tomadas después de 24 h de incubación. Análisis de las células de distribución se basa en (1) la intensidad de fluorescencia de etiquetado FITC (eje x), que se relaciona positivamente con el nivel de incorporación de BrdU, y (2) dispersión lateral (SSC, eje y), que está positivamente relacionado con la célula tamaño. Puerta de la notación se basa en el nivel de incorporación de BrdU, (HI, de alta BrdU incorporación, LI, bajo BrdU incorporación). El porcentaje relativo de HI y las células LI se muestran en la puerta correspondiente.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
<li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+stains%3A+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li>
<li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li>
<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Nuestras parejas enfoque BrdU incorporación, FACS y análisis de 16S ADNr para permitir que las especies a nivel de identificación de bacterioplancton que metabolizan los componentes individuales de DOC en los ambientes acuáticos. El ensayo de incorporación de BrdU etiquetas de las células bacterianas sobre la base de las actividades metabólicas, lo que permite el análisis sólo en las bacterias activas y por lo tanto no incluye a las células inactivas. En nuestro enfoque, la incorporación de BrdU se encuentra en...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> P2308-25MG </td><td></td></tr><tr><td> In Situ proliferación de células Kit, Fluos </td><td> Equipo </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Consumir más de Anti-BrdU-Fluos tampón de incubación y por la reacción que lo sugerido por el fabricante. </td></tr><tr><td> Sello marco de las cámaras de incubación </td><td> Material </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de membrana de policarbonato (142 mm de diámetro, 1,0 m de tamaño de poro) </td><td> Material </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de membrana de policarbonato (25 mm de diámetro, 0,2 m de tamaño de poro) </td><td> Material </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> ilustración PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads </td><td> Equipo </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick gel extracción kit </td><td> Equipo </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe de PCR System </td><td> Equipo </td><td> EPICENTRO </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) el etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Los microbios son los principales agentes de mediación de la degradación de muchos de carbono orgánico disuelto (COD) sustratos en los ambientes acuáticos. Sin embargo, la identificación de los taxones de bacterias que transforman las piscinas específicas de DOC en la naturaleza supone un reto técnico. A continuación se describe un enfoque que las parejas bromodesoxiuridina (BrdU) incorporación, la fluorescencia de células activadas clasificación (FACS), y 16S ARNr de análisis basados ​​en genes molecular que permite que la cultura independiente de la identificación de bacterioplancton capaces de degradar un compuesto DOC específicas en los ambientes acuáticos. Microcosmos por triplicado bacterioplancton están preparados para recibir tanto BrdU y un compuesto modelo DOC (DOC modificaciones), o sólo BrdU (sin adición de control). Sustitutos de BrdU las posiciones de la timidina en el ADN de nueva síntesis bacteriana y BrdU marcado de ADN puede ser fácilmente immunodetected 1,2. A través de una de 24 horas de incubación, bacterioplancton que son capaces de utilizar el compuesto añadido DOC se espera que se activan selectivamente, y por lo tanto, tienen mayores niveles de incorporación de BrdU (células HI) que no responde a las células en las enmiendas DOC y las células no- Además de los controles (bajo recuento de incorporación de BrdU, las células LI). Después de inmunodetección de fluorescencia, las células se distinguen HI y separadas físicamente de las células LI por clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) 3. Ordenado DOC-respuesta (células HI) se extraen de ADN y taxonómicamente identificados a través de 16S rRNA gen posterior análisis basados ​​en PCR como, la construcción de la biblioteca y la secuencia de clon.

Bacterioplancton ambientales se incuban con un modelo del carbono orgánico disuelto (COD) y un reactivo compuesto de ADN de etiquetado, bromodesoxiuridina (BrdU). Después, DOC-degradantes células se separan de la comunidad a granel en base a su elevada incorporación de BrdU utilizando fluorescencia clasificación de células activadas (FACS). Estas células son identificadas por los posteriores análisis molecular.

Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton

Los microbios son agentes principales que median la degradación de numerosos sustratos de carbono orgánico disuelto (COD) en entornos acuáticos. Sin embargo, la identificación...

Los microbios median la degradación de numerosos sustratos de carbono orgánico disuelto o compuestos de COD, como en ambientes acuáticos y de Racine. Para comprender completamente el papel de los microbios en la transformación del COD, es necesario identificar simultáneamente su taxonomía y función. Este video demuestra un procedimiento para la identificación taxonómica de bacterias de vida libre o bacterias planctónicas que transforman reservorios específicos de COD y ambientes acuáticos.Las muestras de agua recolectadas de un ambiente de prueba se procesan e incuban con un compuesto de interés y bromodesoxiuridina, BRDU, que se incorpora al ADN recién sintetizado y a las células en crecimiento activo. A continuación, el plancton bacteriano marcado con BRDU se etiqueta con anticuerpos anti-BRDU conjugados con ZI. El plancton bacteriano con altos niveles de marcado con BRDU se aísla mediante clasificación celular activada por fluorescencia.El ADN se extrae luego de las células ordenadas y se realiza la identificación taxonómica basándose en los resultados del análisis del gen del ARN ribosomal 16 s mediante PCR. Hola, mi nombre es Steven Robbins del laboratorio de la Dra. Chen Mao en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de Kent. Hoy, lu y yo les mostraremos un método independiente de cultivo para la identificación de bacterias planctónicas que degradan el DOC en ambientes acuáticos.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la adición de nutrientes, seguida de análisis del ADN de la comunidad bacteriana, es que centra el análisis en bacterias altamente activas y excluye células inactivas y de crecimiento lento. Aquí mostramos la identificación de bacterias de plátano que utilizan un compuesto específico de DOC. Sin embargo, este método también puede aplicarse para estudiar el plancton bacteriano que utiliza otro compuesto individual de DOC o grupos de DLC, como los exudados de algas.Entonces, obtengamos algunas muestras de agua y comencemos. Antes de analizar las muestras de agua para detectar bacterias planctónicas que degradan el DOC, las muestras de agua deben procesarse adecuadamente. Las muestras mostradas aquí se recolectaron de la costa de Georgia para eliminar partículas grandes y ER VREs de la muestra de agua.Utilice una bomba peristáltica para transferir agua desde el garrafón de recolección a una unidad de filtración con un filtro de tamaño de poro de un micrómetro. A continuación, transfiera alícuotas de 36 mililitros del filtrado a tres tubos estériles de polipropileno de 50 mililitros. Cada uno conteniendo cuatro mililitros de solución al 10 % de paraformaldehído recién preparada. Incube durante dos horas a temperatura ambiente para preservar las células tras la incubación.Vierta el agua en la torre de filtración de una unidad de filtración al vacío de vidrio con filtros de membrana blanca de 0,22 micrómetros de tamaño de poro y aplique vacío para hacer pasar la solución a través del filtro. Lave el filtro aplicando 10 mililitros de PBS a través del filtro al vacío. Etiquete los filtros como controles negativos y almacénelos a menos 20 grados Celsius.Para establecer un ecosistema experimental o microcosmos, comience llenando seis frascos de vidrio de un litro, previamente enjuagados, con 800 mililitros de la muestra de agua previamente filtrada. Añada BRDU a cada microcosmos hasta una concentración final de 10 micromolar. Gire rápidamente el frasco manualmente para mezclar.Se analizará cada muestra por triplicado. Por lo tanto, añada el compuesto modelo de DOC a tres de los microcosmos. Aquí se añade reina a los microcosmos a una concentración final de 100 nanomolares.Luego, a los otros tres microcosmos añada PBS estéril. Estos servirán como controles sin DOC. Coloque todos los microcosmos en un incubador con agitación a 100 RPM, en oscuridad y a la temperatura in situ, que es de 25 grados Celsius. En este punto, realice tomas de muestra a las 0, 8, 16 y 24 horas.Recolecte 36 mililitros de cada microcosmos en un tubo de polipropileno estéril de 50 mililitros que contenga cuatro mililitros de paraformaldehído fresco al 10%, incube durante dos horas a temperatura ambiente para fijar las células. A continuación, filtre las células fijadas a través de filtros membrana blancos con un tamaño de poro de 0,22 micrómetros. Aplique 10 mililitros de PBS mediante filtración al vacío para eliminar los residuos de PFA.Proceda inmediatamente a la detección inmunológica in situ INS o almacene los filtros a menos 20 grados Celsius para analizar la incorporación de BRDU en el plancton bacteriano. Comience colocando los filtros de muestra a temperatura ambiente para debilitar la pared celular bacteriana. Coloque el filtro en una unidad de filtración, luego pipetee un mililitro de solución de lisozima sobre el filtro para cubrir las células e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.Tras la incubación, aplique vacío para eliminar la solución. Una vez que la solución atraviese el filtro, lave las células añadiendo 10 mililitros de PBS y aplique vacío. Luego, para dañar aún más la pared celular, añada un mililitro de solución de proteinasa K al filtro para cubrir las células.Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar con PBS para obtener ADN de estratos simples. Añadir un mililitro de solución de exonucleasa para cubrir las células en el filtro.Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Tras la incubación, lavar el filtro pasando 10 mililitros de PBS a través del filtro al vacío. A continuación, recortar los bordes del filtro para eliminar la porción que no tiene células.Luego, sobre una superficie seca limpia con alcohol, utilice una hoja estéril para cortar el filtro en ocho trozos de tamaño igual. Se necesitan ocho cámaras de incubación con sello de marco para cada muestra; coloque un octavo del filtro en cada cámara de incubación con sello de marco, con el lado de la muestra hacia arriba. Una vez que las cámaras estén ensambladas, utilice el reactivo del kit de proliferación celular Roche Intu para detectar in situ las células marcadas con A-B-R-D-U.Una vez que finalicen los procedimientos de incubación, retire la sección del filtro de la cámara de incubación y colóquela sobre una superficie estéril; utilizando una hoja estéril, córtele la sección del filtro en trozos pequeños. Transfiera los trozos de filtro a un tubo microcentrífugo de dos mililitros que contenga un mililitro de PBS, cierre herméticamente el tubo y séllelo con parafina. A continuación, incube el tubo en un agitador orbital a 37 grados Celsius y 200 RPM durante 10 minutos.Tras la incubación, asegure el tubo y agítelo en vórtex a máxima velocidad. Durante cinco minutos, aspire el sobrenadante SUP y transfiéralo a un tubo estéril de polipropileno de 15 mililitros. Luego, reuspenda el filtro en PBS y repita los pasos de vórtex e incubación dos veces más, añadiendo cada vez el snat al mismo tubo de 15 mililitros para cada muestra.Almacene las células resuspendidas a cuatro grados centígrados. La muestra debe analizarse mediante fax dentro de dos días. Finalmente, separe las células para obtener la población con alto nivel de incorporación de BRDU.Aquí se utiliza un citómetro de flujo de área BD fax y el software correspondiente. Una vez que las células han sido ordenadas, la población enriquecida con BRDU puede ser analizada para determinar su identidad taxonómica. Para amplificar los genes de ARN ribosómico 16 s de bacterias, se realizan PCR en filtro; pipetee las células ordenadas sobre un filtro de membrana de policarbonato blanco con un tamaño de poro de 0,22 y encienda la bomba de vacío, luego, usando una hoja estéril, recorte los bordes libres de células del filtro.Corte el filtro en cuatro trozos de tamaño igual para cada condición, coloque un solo trozo de filtro en cada uno de tres tubos de reacción PCR con las células orientadas hacia el interior del tubo. Añada 45 microlitros de agua para PCR. Deje que la sección del filtro se sumerja completamente en el agua.A continuación, agregue dos perlas Roche illustra pure T ready to go PCR e invierta brevemente para ayudar a disolver las perlas. Luego, agregue dos microlitros de cada cebador, sentido directo y sentido inverso, del gen del ARN ribosómico 16 s.Agregue un microlitro de BSA para ayudar a absorber los inhibidores de la amplificación o un microlitro de agua. Realice la amplificación por PCR en un termociclador. Se recomienda un programa de PCR con temperatura decreciente, en el cual la temperatura de hibridación disminuye secuencialmente de 62 a 52 grados Celsius en un grado Celsius por ciclo, seguido de 15 ciclos a 52 grados Celsius.Confirme la amplificación por PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio, excise los amplicones de PCR del gel y purifíquelos con un kit rápido de extracción de geles KaiGen cayo. Después de la purificación en gel de PCR, reúna los amplicones de la misma muestra. Los amplicones purificados de ADN ribosómico 16 s ya están listos para varios análisis moleculares.Las muestras se recolectaron de un sitio costero de Georgia y se procesaron para estudiar bacterias degradadoras de racina siguiendo los procedimientos descritos en este video. La racina es un compuesto poliamínico que puede encontrarse ampliamente en ambientes marinos. Puede servir como fuente de nutrientes y energía para bacterias marinas, como se muestra aquí.El análisis de hechos de las muestras reveló que, tras una incubación de 24 horas, se desarrolló en los microcosmos suplementados con Racine un grupo de bacterias con un mayor nivel de intensidad de fluorescencia de FXI, que estaba relacionado positivamente con el grado de incorporación de BRDU. Estas células fueron denominadas células con alta incorporación de BRDU o HI y se esperaba que contuvieran principalmente bacterias degradadoras de Racine. No hi.Se encontraron células en los controles sin adición, que solo contenían células con niveles más bajos de incorporación de BRDU, denominadas células lii, que se esperaba que contuvieran principalmente bacterias planctónicas que no pudieron utilizarse. Las células Racine HI agregadas fueron separadas en tubos distintos y luego recolectadas en filtros de membrana. Se obtuvieron amplicones parciales del gen ribosómico 16S de ARN después de la PCR con filtro y se confirmaron mediante electroforesis en gel.Tras el filtrado de clasificación, también se puede realizar la amplificación por PCR de genes funcionales para examinar la diversidad funcional entre las células clasificadas. Acabamos de mostrarle cómo separar e identificar físicamente células bacterianas funcionales en un ambiente acuático utilizando un enfoque que combina la clasificación fluorescente de células activadas y la incorporación de BRDU. Recuerde que se debe usar siempre BIDU, ropa de protección, una bata de laboratorio y guantes al realizar este procedimiento.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

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Biología

Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

Rastreo cambios sutiles en la progresión y la cinética de las fases del ciclo celular puede llevarse a cabo mediante el uso de una combinación de marcaje metabólico de los ácidos nucleicos con BrdU y tinción de ADN genómico total a través de yoduro de propidio. Este método evita la necesidad de sincronización química de ciclo de las células, impidiendo así la introducción de daño en el DNA no específico, que a su vez afecta a la progresión del ciclo celular.

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con...

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

El video describe el ensayo de marcaje de pulso escalonado de células de mamíferos con bromodeoxiuridina (BrdU) para medir la proliferación celular. La absorción de BrdU permite el seguimiento temporal de las células que estaban en la fase de síntesis en un momento específico, sin necesidad de que las células estén sincronizadas.

Ensayo de marcaje de pulsos de bromodeoxiuridina: una técnica para medir la proliferación celular

Este vídeo describe el protocolo para la tinción de inmunofluorescencia BrdU. La técnica permite la identificación de células en diferentes fases del ciclo celular. La adición de colorantes de ADN y el marcaje de anticuerpos permite el análisis detallado del destino de las células de la fase S en momentos posteriores.

Tinción de inmunofluorescencia BrdU: una técnica para identificar células en diferentes fases del ciclo celular

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Aquí se presenta un protocolo para una técnica monocelular basada en microscopía de epifluorescencia para cuantificar las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos con alta precisión y resolución taxonómica.

Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D2O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.

Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Aprende a identificar bacterioplancton degradador de carbono orgánico disuelto mediante etiquetado con BrdU y clasificación por citometría de flujo. Este método permite aislar células activas para estudios de ecología microbiana.

Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton (Video) | JoVE Journal

Bromodeoxyuridine (BrdU) El etiquetado y posterior clasificación de células activadas fluorescencia para la Cultura independiente de la identificación de carbono orgánico disuelto degradación bacterioplancton

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