ReAsH / Flash etiquetado y análisis de imágenes de las proteínas en las células del sensor Tetracysteine

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar las células que expresan una tetracisteína y una proteína marcada con fluorescencia con los colorantes flash o cenizas, y analizar cuantitativamente los resultados. Esto se logra mediante el primer seccionamiento, un plásmido que transporta una proteína fluorescente y la proteína objetivo que contiene una etiqueta de tetracisteína en la línea celular de interés. A continuación, la proteína expresada se etiqueta con R o flash, y la dieta no ligada específicamente se elimina lavándola con BAL para prepararla para la obtención de imágenes microscópicas.

A continuación, se utiliza un microscopio confocal para recoger imágenes fluorescentes de las células con los canales de cenizas o flash y proteínas fluorescentes. Finalmente, las imágenes se analizan utilizando la imagen J para cuantificar la unión de las cenizas o destellos a la proteína diana. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el grado de unión de las cenizas o los relámpagos a la proteína diana en las células a través de la correlación de la fluorescencia de las cenizas con la fluorescencia de las proteínas fluorescentes.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como simplemente tomar la proteína objetivo con GFP, es que puede rastrear una segunda propiedad de la proteína, como el cambio conformacional, además de su localización. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la subestructura y la función de la proteína, como los eventos de ización, los cambios conformacionales y los eventos de unión a LI que alteran la capacidad del TAC para prohibir las cenizas o el destello. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando quisimos evaluar cómo se formaban en las células pequeñas polígamas submicroscópicas de Huntington.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de análisis de datos son difíciles de aprender porque son técnicamente complejos. Los pasos uno a tres serán Yasmin Ranson, asistente de investigación de nuestro laboratorio, quien demostrará el análisis de datos. El cuarto paso será Sevki GaN, un estudiante graduado de nuestro laboratorio que utiliza métodos estándar de cultivo celular para su línea celular de interés y un portaobjetos de imágenes de células vivas listo para la transfección.

Prepare un cultivo de células de adherencia para transfectar su plásmido que contenga el gen de la etiqueta TC de interés. De acuerdo con el método de transfección elegido, es importante tener controles positivos y negativos para evaluar el grado de unión específica a las etiquetas TC, así como para evaluar el flujo de fluencia de lejía entre canales cuando se recolectan micrografías confocales. Por lo tanto, para dos colores, asegúrese de que las muestras estén preparadas para colores individuales, ya sea la proteína fluorescente por sí misma y, si es posible, una proteína T ctech unida a la carne o vs.

Pero sin una proteína fluorescente. Uno o dos días después de la transfección, enjuague suavemente las células con 300 microlitros de solución salina de equilibrio de Hank de antes de la guerra o HBSS, prepare HBSS precalentado fresco con 10 micromolares, uno, dos, et Ethan dia thiol o EDT y un flash o ceniza de micromolar. Y después de eliminar el HBSS de las células, reemplácelo suavemente con 300 microlitros del medio de ceniza e incube durante exactamente 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos.

En nuestra experiencia, los tiempos de incubación más largos aumentan significativamente la fluorescencia de fondo. Aspire suavemente la solución de etiquetado de las células y reemplácela con 300 microlitros de HBSS precalentado con 250 micromolares, dos dímeros triples, propanol tapado o BAL durante 15 minutos a 37 grados Celsius. Retire la solución de lavado mediante una aspiración suave y reemplácela con 300 microlitros de HBSS precalentado.

Después de este lavado, las células pueden fijarse con altura de paraforma, aunque encontramos que esto aumenta la fluorescencia cínica inespecífica. Por lo tanto, generalmente obtenemos imágenes de las células vivas a temperatura ambiente. Además, la fijación de las células antes del etiquetado evita la unión del colorante bial.

Para comenzar a obtener imágenes de las células en el microscopio confocal, configure los parámetros para obtener imágenes de los fluoróforos individuales y asegúrese de que haya un sangrado insignificante entre los canales. A continuación, ajuste la configuración del multiplicador de fotos para que la fluorescencia máxima de la muestra no sature el detector. Una vez que se hayan determinado los mejores ajustes de imagen, no cambie ninguno de ellos entre muestras.

Utilice una velocidad de escaneo de 200 hercios, recopile cuatro promedios de línea y establezca el diámetro del orificio en una unidad de área. El diámetro del orificio se puede ampliar si la señal es un problema. Sin embargo, esto puede resultar en cierta pérdida de resolución de la imagen.

Recopile las imágenes confocales en un formato de 12 bits o superior si es posible. Maximizar la calidad del análisis de datos cuantitativos. Recopile imágenes para el canal de proteína fluorescente y también para el canal de matriz del arsenal de BI para todas las muestras.

Para analizar los datos, utilice el software Image J con los siguientes complementos. Si utiliza una versión de Image J anterior a la versión 1.32 C, haga clic en las siguientes opciones. Para permitir que se abran varias imágenes a la vez, las opciones de edición ingresan la salida de barra diagonal, haga clic en la casilla para usar el selector de archivos j para abrir el recurso compartido de barra diagonal.

Haga clic en Aceptar. Abre las imágenes que te interesen. La imagen J definirá automáticamente las intensidades de píxeles máximas y mínimas que se muestran en la pantalla para cada imagen por separado, ya que las diferentes imágenes tendrán diferentes intensidades de píxeles.

Esto significa que las imágenes mostradas no son comparables a las vistas. Para asegurarse de que todas las imágenes abiertas estén en la misma escala, defina físicamente las intensidades de píxeles superior e inferior que se van a ver. Para establecer estos valores, elija la imagen, ajuste el brillo, la barra oblicua, el contraste.

Haga clic en establecer, defina los valores mínimos y máximos mostrados. A continuación, elija propagar a todas las imágenes abiertas y haga clic en Aceptar. Alternativamente, coloque todas las imágenes de un canal en particular juntas en un solo archivo o pila.

La imagen J ajustará automáticamente todas las imágenes a la misma escala. Para ello, elija las pilas de imágenes que se van a apilar, introduzca un nombre común a cada archivo y elija los títulos usados como etiquetas. Haga clic en Aceptar.

Convierta todas las imágenes abiertas a ocho bits para su análisis. Al elegir el tipo de imagen de ocho bits, se reescalará el rango visto a un intervalo de cero a 255. Es importante no guardar en el formato original de 12 bits o superior, ya que esto perderá el contenido de la información.

Guarde una copia en una nueva carpeta llamada conversión de ocho bits usando la opción Guardar como. Un método para examinar el grado de unión de troqueles biarsales en una imagen completa es realizar un gráfico de correlación de intensidad de píxeles. Este gráfico representa cada valor de píxel en un canal en relación con el valor de píxel correspondiente en un segundo canal.

Por lo tanto, una posición de píxel alta en fluorescencia GFP también será alta en fluorescencia de cenizas si hay una alta unión. Para analizar la correlación de píxeles co, asegúrese de que las imágenes REA y GFP de ocho bits estén abiertas en la imagen J.A continuación, abra el complemento del correlacionador de imágenes eligiendo el correlacionador de imágenes de complementos. Asigne los archivos de imagen a la imagen uno y a la imagen dos.

A continuación, haga clic en Aceptar. Es posible que la pila resultante no muestre ninguna información detallada. Esto es normal.

Guarde la pila en una nueva carpeta llamada scatterplots y asígnele el mismo nombre de archivo que la muestra a la que hace referencia. Por ejemplo, el gráfico de correlación GFP de Ash. Para ver los datos, elija una de las dos opciones.

En primer lugar, transforme los datos para que tengan un formato de registro eligiendo process math log auto. A continuación, para cambiar visualmente la escala de los datos, haga clic en la imagen, ajuste el brillo, la barra diagonal, el contraste y seleccione automático. En segundo lugar, cambie la escala de los datos visualmente para mostrar solo valores bajos y muestre los datos mediante una tabla de búsqueda especial o LUT para crear una LUT personalizada.

Haga clic en LUT de edición de color de imagen para obtener una LUT muy simple. Haz clic en el píxel superior izquierdo y elige el color negro. A continuación, seleccione el siguiente píxel a la derecha y elija el color rojo.

A continuación, haga clic en el tercer píxel y, mientras mantiene presionado el botón del mouse, arrastre la selección al píxel inferior derecho. Seleccione el color rojo, haga clic en Aceptar y, a continuación, seleccione el color blanco y haga clic en Aceptar. Seleccione el rango de contraste de barra diagonal de brillo de cero a 255 como se describió anteriormente para bloquear la imagen a la que se muestra en la pantalla.

Conviértelo a formato RGB para copiar y pegar imágenes en otros programas. Primero, abra las imágenes de ocho bits o 16 bits como se describió anteriormente. Asigne un esquema de color LUT a las imágenes para GFP.

Asigne la LUT verde haciendo clic en la imagen. Busque las tablas en verde. Por último, seleccione la imagen que desea copiar y cópiela en el portapapeles Al elegir editar copia al sistema, esta figura muestra un resultado típico para el calcetín de quinasa fusionado, el GFP y una etiqueta TC que se ha manchado durante 30 minutos.

Con cenizas en células HEC 2 9 3, parece que ASH se une eficientemente a la proteína diana que lleva una etiqueta TC con alta afinidad. Por el contrario, esta figura muestra la muestra de control correspondiente de SARK fusionado con GFP, pero sin la etiqueta TC, que es esencial para verificar tanto la especificidad de la etiqueta TC como el nivel de tinción de fondo. Este resultado muestra que RH no tiene reactividad con la proteína diana, careciendo de la etiqueta TC, lo que indica la especificidad de la etiqueta TC para la unión a SSH.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe permitir que las células sean confluentes y tranquilas, ya que esto afectará la unión V en las células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar sus datos de manera simple y cuantitativa, y puede refinar estos métodos para desarrollar su propio IITS único para la visualización de datos.