Name: GABA corrientes activadas de un solo canal y Tonic en rodajas de cerebro de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprende a registrar corrientes de canal único activadas por GABA en neuronas de rata usando la técnica de patch-clamp. Este método diferencia canales sinápticos y extrasinápticos para estudiar la excitabilidad neuronal.

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Este trabajo fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación, Universidad de Uppsala y Fredrik y Ingrid Thurings Fundación. ZJ celebró una beca postdoctoral de EXODIAB y Svenska för Sällskapet Medicinsk Forskning. Damos las gracias a Frank Lee para la asistencia técnica.

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</ol>

La corriente de célula entera representa el conjunto de las corrientes generadas por los canales activos en la célula. La farmacología específica y la permeabilidad de los canales de cloruro de GABAA permite identificar las corrientes asociadas a estos canales. La naturaleza transitoria de activación de los canales sinápticos y la activación tónica de los canales de extrasinápticos permite diferenciar fácilmente entre estas dos poblaciones de los canales GABAA expresado en una neurona. Sin embargo, sólo con un solo canal de grabaciones se puede estudiar las propiedades cinéticas de las moléculas de los canales que generan las corrientes tónico. A diferencia de los canales sinápticos que se activan a menos de 100 ms, los canales GABAA tónica se activan con una latencia en el rango de minutos desde el momento GABA se aplica 4,7,15,16,17,18. Esta activación retardada de los resultados de los canales en que las propiedades de los canales que muchos no pueden ser estudiados usando células enteras grabaciones. En el ámbito de un solo canal de los diferentes sub-poblaciones de los canales GABAA pueden ser identificados en base a diferentes propiedades funcionales y farmacológicas. Por lo tanto, tomando una ventaja de lo que las diferentes configuraciones de patch-clamp tienen que ofrecer, es posible estudiar en detalle la función molecular y la farmacología de los canales activados por GABA que generan las corrientes tónico y sináptica de las neuronas.

Varios de patch-clamp sistemas hardware y software están disponibles y todos ellos funcionan con los mismos principios básicos. En nuestro laboratorio utilizamos los amplificadores Axoclamp y el software pCLAMP (Molecular Devices, EE.UU.) para registrar y analizar los experimentos. Otra marca popular es HEKA amplificadores y software (HEKA Elektronik, Alemania) Microforge: Narishige MF-830 (Japón); Vibrotome: por ejemplo, Leica VT1200S (Alemania) o Campden Instrumentos vibrotome (Reino Unido); microscopio: Nikon Eclipse E600FN, Baño de agua; Micromanipuladores: hecho a medida y micromanipuladores Narishige (Japón); Extractor: DMZ- universal (Alemania) o Narishige PC-10 (Japón). Electrodo de vidrio: GC150F-15 (Harvard Apparatus, Reino Unido).

gaba corrientes activadas de un solo canal y tonic en rodajas de cerebro de rata

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

El GABA A los canales están presentes en todas las neuronas y se encuentran tanto en las sinapsis y fuera de la sinapsis donde se generan las corrientes fásica y tónica, respectivamente 4,5,6,7 El GABA Un canal es un pentamérica GABA-gated canal de cloro. Las subunidades de los canales se agrupan en 8 familias (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π y ρ). Dos alfas, betas dos y tres subunidades ª formar el canal funcional 8. Mediante la combinación de estudios de la sub-tipo específico GABA activado por un solo canal con las moléculas de estudios con todas las poblaciones de GABA A los canales en la neurona es posible entender el mecanismo básico de la inhibición neuronal y cómo se modula por agentes farmacológicos. Utilizamos la técnica de patch-clamp 9,10 para estudiar las propiedades funcionales de los canales GABA en las neuronas vivas en rodajas de hipocampo del cerebro y el registro de un solo canal y las corrientes de células enteras. Hemos de seguir examinando la forma de los canales se ven afectados por diferentes concentraciones de GABA, otras drogas y los factores intra y extracelulares. Para una descripción detallada teórica y práctica del método de patch-clamp consulte la de un canal de grabaciones editadas por Sakman B y E Neher 10.

Utilizamos la técnica de patch-clamp para medir GABA-activa de un solo canal corrientes (GABAA canales, los receptores GABA A) y las corrientes sinápticas y tónico que generan en las neuronas. La activación de los canales disminuye la excitabilidad neuronal en la salud y la enfermedad<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

GABA corrientes activadas de un solo canal y Tonic en rodajas de cerebro de rata

Los canales GABAA están presentes en todas las neuronas y se localizan tanto en las sinapsis como fuera de ellas, donde generan corrientes fásicas y tónicas, ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en registrar las corrientes activadas por GABA generadas por moléculas individuales, la corriente de canal unitario, y por poblaciones específicas de canales localizados en sinapsis o fuera de las sinapsis. Esto se logra primero preparando cortes de cerebro de rata hippocampal y fabricando pipetas que se utilizarán para el registro en parche. Como segundo paso, se une una pipeta a la membrana neuronal.Después de la formación de un sello gigaojal, se obtiene la configuración del parche en modo célula adherida. A continuación, aplique succión a la pipeta. Una vez que se rompe la membrana y se accede al interior de la célula, se establece la configuración del parche en modo célula completa.Se obtienen resultados que permiten diferenciar entre canales Gabaa sinápticos y extrasinápticos. La principal ventaja de la técnica de bloqueo con pipeta frente a métodos existentes como emit consiste en que permite estudiar las propiedades funcionales de los canales. El método de bloqueo con pipeta puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como qué determina la excitabilidad de las neuronas y cómo se modula y ajusta finamente.Las implicaciones de esta tecnología se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de muchas enfermedades, ya que toda célula viva depende de canales iónicos que funcionen adecuadamente para su supervivencia y su función celular especializada. Quien demostrará el procedimiento será el investigador posdoctoral principal del laboratorio y Young Yin, una estudiante de posgrado del laboratorio. Para comenzar este procedimiento, sacrifique una rata Wistar de 16 a 22 días posteriores al nacimiento mediante decapitación y extraiga rápidamente el cerebro con una espátula. Corte el cerebro a lo largo de la línea media con una hoja de bisturí quirúrgico.A continuación, coloque cada hemisferio sobre un papel filtro Watman con la superficie cortada hacia el papel. Coloque una gota de pegamento instantáneo sobre el disco del espécimen y coloque el hemisferio encima con la superficie cortada hacia abajo. Luego, coloque el disco del espécimen en la cámara de corte del vibrátomo que está lleno de hielo frío.Un LCR. Ajuste el grosor de corte a 400 micrómetros e inicie el corte del cerebro. Corte aproximadamente dos milímetros de tejido cerebral hasta llegar al hipocampo.A continuación, coloque las secciones del hipocampo en una placa de Petri de vidrio llena con un LCR. La placa se coloca sobre un fondo negro para permitir una fácil visualización del hipocampo. El siguiente paso consiste en aislar el hipocampo del tejido circundante utilizando una hoja quirúrgica afilada.Tenga cuidado de no empujar ni tirar del tejido después de eso. Incube las secciones y la solución A CSF a 37 grados Celsius durante una hora, y luego manténgalas a temperatura ambiente hasta que finalicen los experimentos. Se utilizan capilares de vidrio borosilicatado para las pipetas de registro. Extraiga las pipetas de registro con un micropipeteador automático o manual, obteniendo una resistencia de dos a cuatro megaohmios para registros en célula completa, u ocho a 20 megaohmios para registros de canales individuales. Pule la pipeta con el mismo vidrio de borosilicato para el registro de canales individuales. Utilizando un microhorno, derrita el vidrio de borosilicato sobre el alambre de platino para hacer la punta más suave.Pulir las pipetas de esta manera crea pipetas que forman sellos más estables y con mayor resistencia en comparación con las pipetas pulidas mediante el calor de un alambre sin recubrimiento o mediante un paso de pulido en el extractor automatizado. El equipo de registro de parches consta de un microscopio sobre una mesa flotante y encerrado en una jaula de Faraday, un amplificador, un digitalizador y un ordenador. En conjunto, este equipo suele denominarse sistema de registro de parches.Ahora inserte una pipeta en el porta-pipetas y apriete la tapa para fijar la pipeta. El P clamp se utiliza como el software de registro en modo de parche. Configure el amplificador OC clamp 200 B en modo V clamp, con una ganancia de dos, filtro de dos kilohercios y el potencial de retención en cero milivoltios; para crear presión positiva en la pipeta, sople aire en la boquilla que está conectada al tubo que a su vez se une al porta-pipetas.Luego cierre la válvula entre la boquilla y el tubo. Asegúrese de que no haya fugas de aire. A continuación, introduzca la pipeta en la solución del baño.En la pantalla del ordenador donde se mide la resistencia de la pipeta, verá un pulso generado por un tren de pulsos de cinco milivoltios y un número que indica la resistencia de la pipeta. Los números más pequeños representan aberturas mayores en la punta de la pipeta y pipetas más grandes. Ajuste el offset de la pipeta en el amplificador a cero.Utilice un aumento de 10x en el microscopio para identificar la región, o un aumento de 60x. Para identificar una neurona parametal que va a sellar en los cortes de hipocampo, las células granulares del giro dentado, la región del cuerpo celular de la CA1 parametal y la región del cuerpo celular de la CA3 parametal aparecen cada una como una banda brillante. Enfocar la pipeta para que pueda ver tanto la región o célula como la pipeta.Al observar a través de los oculares del microscopio, coloque la pipeta por encima de la mitad de la región utilizando el ajuste del manipulador de movimiento grueso y baje la pipeta hasta que esté justo encima, pero en contacto con el tejido. En este momento, baje muy suavemente la pipeta sobre el centro de la célula o región utilizando los ajustes de movimiento fino del manipulador. Al mismo tiempo, observe la pantalla del computador para controlar la resistencia de la pipeta.Continúe bajando la pipeta hasta que la resistencia de la pipeta aumente. Libere la presión positiva de la pipeta abriendo la válvula. Esto crea una succión suave y forma automáticamente el sello gigaseal.Si no se forma el sello giga, aplique succión a la boquilla donde previamente aplicó presión positiva. Ahora ha obtenido la llamada configuración de parche adherido a la célula. Ajuste la compensación rápida y lenta de la capacitancia para cancelar el transitorio proveniente de la pipeta y del porta-pipetas.En la pantalla del ordenador, verá un trazo de corriente plano. Cuanto mayor sea el valor de GigE, mejor relación señal-ruido tendrá en los registros de canales individuales para grabar corrientes de canales unitarios con una configuración de parche unido a la célula. Ajuste la ganancia a 500 y la frecuencia de muestreo de datos a no menos de 100 microsegundos.Luego registre las corrientes. Mantenga el volumen de la solución de baño bajo, de modo que apenas cubra el corte, para minimizar el ruido en los registros durante el registro de célula completa. Cambie el potencial de la pipeta a menos 60 milivoltios o cerca del potencial de membrana en reposo.En la configuración de celda unida, aplique succión a la pipeta mediante el tubo conectado al porta-pipetas. Al mismo tiempo, observe los cambios en la resistencia y el transitorio de capacitancia en la pantalla del ordenador. Una vez que haya penetrado en la celda.Cuando esto ocurre, se encuentra en la llamada configuración de célula completa o modo de célula completa. Permita que la solución del pipeta se equilibre con el interior de la célula durante cinco a 10 minutos. Mientras tanto, controle el valor de la resistencia en serie.La corriente es transportada por las poblaciones de canales abiertos en la membrana celular. Para demostrar los canales individuales activados por GABA, se añade GABA a la solución del pipeta, ya que no puede atravesar la membrana celular. Aquí se muestran las corrientes de canales individuales activadas por una concentración de 20 nanomolar de GABA en un parche unido a la célula sobre una neurona granular del giro dentado.El parche se despolarizó en 40 milivoltios. La conductancia máxima del canal fue de 44 picosiemens y su latencia de activación fue de 2,63 minutos. A continuación se muestra un ejemplo de cómo diferenciar las corrientes de GABA, sinápticas y extrasinápticas, según la naturaleza fásica y tónica de las corrientes.Se registró la corriente a través de poblaciones de canales en neuronas hipocámpicas de rata mediante el método de bloqueo de voltaje en célula completa para identificar corrientes tónicas y fásicas. Se aplicó 100 micromolar del antagonista de gabaa SR 95531 a una neurona del giro dentado como se indica en BA y a una neurona paramedial tratada con insulina como se indica en BB. SR 95531 bloqueó los canales extrasinápticos e indujo un desplazamiento en la corriente de línea base, lo que reveló la corriente tónica.Una vez dominada, obtener un parche adherido a la célula y luego penetrar en la célula para establecer un parche de célula completa puede hacerse en menos de dos minutos. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar el parche sobre otros tejidos como islotes pancreáticos intactos o células aisladas como linfocitos o células en cultivo.

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Investigación

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Neurociencia

Este informe demuestra una técnica para aislamiento mecánico de las neuronas individuales viable mantener unido boutons presináptica. Vibrodissociated neuronas tienen la ventaja de una rápida producción, el control farmacológico excelente y mejora del espacio-clamp sin la influencia de las células vecinas. Este método puede ser utilizado para obtener imágenes de los elementos sináptica y la grabación de patch-clamp.

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