Name: Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende a inmovilizar bacterias vivas en mica recubierta con gelatina para microscopía de fuerza atómica en entorno líquido. Este método permite obtener imágenes de alta resolución de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas sin tratamiento químico.

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Esta investigación está patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental, Departamento de Energía de EE.UU. y por subvenciones de la Junta de Virginia Commonwealth Investigación en Salud. Oak Ridge National Laboratory es administrado por UT-Battelle, LLC, para el Departamento de Energía de EE.UU. bajo el Contrato No. DE-AC05-00OR22725.

1. Mica de preparación: <ol><li> Cortar la mica (Microscopía Electrónica de Ciencias) con unas tijeras al tamaño necesario para ajustarse al microscopio AFM (aprox. 22 x 30 mm). </li><li> Cleave la mica de ambas partes, generalmente por medio de cinta para quitar la capa externa, hasta que sólo quedan las capas continua suave. </li></ol> 2. Preparación de la solución de gelatina: <ol><li> Añadir 100 ml de agua destilada a una botella de laboratorio. </li><li> Calentar el biberón en el microondas hasta que el agua comience a hervir. (Si el microondas no está disponible, el agua se puede calentar en un vaso sobre un plato caliente.) </li><li> Pesar 0,5 gramos de la gelatina (Sigma G-6144, G 2625-G o 2500) y añadir el agua destilada caliente. </li><li> Haga girar suavemente la botella hasta que la gelatina se disuelva por completo. </li><li> Enfriar la solución de gelatina a 60-70 º C. </li><li> Vierta aproximadamente 15 ml en un vaso pequeño (20 ml) en el que se puede cortar la mica escindida de cruce. </li></ol> 3. Mica de recubrimiento: <ol><li> Sumerja las plazas mica en la solución de gelatina caliente y retirar rápidamente de tal manera que la mica está cubierta (Fig. 1a). </li><li> Después del recubrimiento, el apoyo a la mica de inmediato, en la orilla, sobre una toalla de papel para secarse en el aire ambiente (fig. 1b). La mica recubierta de gelatina se puede utilizar por lo menos 2 semanas. El exceso de solución de gelatina se puede mantener refrigerada y usada por aproximadamente un mes, simplemente calentar la solución de reserva de entre 60-70 º C. Se debe tener cuidado para asegurar que la gelatina no se hierve durante el recalentamiento. </li></ol> 4. Montaje de las bacterias en la mica recubierta de gelatina: <ol><li> Pellet 1 ml de un cultivo bacteriano (0,5 a 1,0 DO a 600 nm) de 800 a 4500 fcr. Dependiendo de la bacteria, el uso de la RCF mínimo que se sedimenten las células de ~ 5 minutos. </li><li> Lavar el sedimento en el mismo volumen de agua filtrada desionizada o tampón. </li><li> Recoger las células de nuevo por centrifugación. </li><li> Resuspender el precipitado con prontitud en 500 L de agua desionizada o tampón Nanopure. (La suspensión bacteriana deberá presentar una apariencia turbia con el fin de tener una concentración adecuada de las células de AFM de imágenes.) </li><li> Solicitar la suspensión de células (10-20 l) de la mica recubiertos de gelatina y se extendió sobre la superficie con una punta de la pipeta (Fig. 1c). Se debe tener cuidado de no contacto físico con la superficie de la gelatina con la punta de la pipeta, mientras que la aplicación o la difusión de la solución bacteriana. </li><li> Permita que la superficie en reposo durante 10 minutos y enjuagar con un chorro de agua o tampón (Fig. 1 cd). A lo largo del procedimiento, tener cuidado de asegurarse que la muestra no se deja secar. </li></ol> 5. Los resultados representativos: La figura 2 muestra imágenes de ejemplo de las células bacterianas que se han montado en gelatina mica recubierta y fotografiada por la AFM. En nuestros laboratorios, las muestras suelen ser fotografiado usando un microscopio de fuerza atómica PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) equipado con un cabezal de escaneado 100 micras. El instrumento es operado a 128-512 píxeles por línea de exploración a una velocidad de escaneo de líneas de 0,5-1,0 / s. Los voladizos que se suelen utilizar son Veeco sondas de nitruro de silicio (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) con las constantes de la primavera nominales que van desde 0,01 hasta 0,1 nN / nm. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gelatina a una temperatura de 60-70 º C se coloca en un vaso de precipitados de 20 ml. Con un par de pinzas recién cortado plazas mica están totalmente inmersos en la gelatina (a) ha retirado y colocado en posición vertical sobre una toalla de papel apoyado en un bastidor de microcentrífuga (b). Una gota de la muestra bacteriana se coloca en la mica y se extendió con una punta de pipeta, tanto en el X e Y (c). Después de permitir que la muestra se incuba en la superficie de la mica por lo menos durante 10 minutos, enjuague la muestra en una corriente de agua destilada. Si la inmovilización trabajado usted podrá ver una mancha opaca en la mica, como se muestra en el panel de la derecha de (d). Si la inmovilización no funcionó obtendrá un pedazo de mica clara como en el panel de la izquierda. La mancha opaca en las escalas de mica a la concentración de la bacteria en la gota que se coloca en la mica de gelatina tratada. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. AFM imágenes de E. coli. En el panel (a), las células se montan en gelatina mica recubierta y la imagen en 0.005 M de PBS. Por comparación, una imagen de las células bacterianas montados en gelatina-mica recubierta y la imagen en el aire se muestra en el panel (b). A pesar de los tabiques son claramente visibles en la imagen recogida en el líquido, mayor resolución, como lo indica la presencia de pili (panel de inserción (b)), se puede obtener en el aire.

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hay varios factores que pueden afectar a las células microbianas y de montaje de imágenes por AFM. La gelatina que se utiliza para el recubrimiento de la mica es importante. Comerciales de gelatina está aislado de una serie de vertebrados, incluyendo peces, vacas y cerdos. El origen y el método de procesamiento de determinar la idoneidad de la gelatina para la inmovilización de bacterias. Numerosas fuentes y tipos de gelatina fueron evaluados para determinar su eficacia en las bacterias inmovilizar [1]. Los dos gelatina...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> G6144, G2625 o G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus Microscopio de Fuerza Atómica </td><td> Agilent Technologies, Tempe, AZ </td><td></td></tr><tr><td> AFM voladizos </td><td> Veeco, Santa Barbara, CA </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM es una de alta resolución (escala nm) herramienta de imagen que las sondas de una superficie mecánicamente. Tiene la capacidad de las células de la imagen y las biomoléculas, en un medio líquido, sin la necesidad de tratar químicamente la muestra. Con el fin de lograr este objetivo, la muestra suficientemente que se adhieren a la superficie de montaje para evitar la extracción de las fuerzas ejercidas por su punta de exploración AFM. En muchos casos, las imágenes éxito depende de la inmovilización de la muestra a la superficie de montaje. De manera óptima, la inmovilización debe ser mínimamente invasiva para la muestra de tal manera que los procesos metabólicos y los atributos funcionales que no están comprometidos. Por el recubrimiento de superficies mica recién abierto, con porcino (cerdo) de gelatina, las bacterias cargadas negativamente pueden ser inmovilizadas en la superficie y la imagen en un líquido por AFM. La inmovilización de las células bacterianas en gelatina mica recubierta es más probable debido a la interacción electrostática entre las bacterias cargadas negativamente y la gelatina con carga positiva. Hay varios factores que pueden interferir con la inmovilización de bacterias, incluyendo los componentes químicos del líquido en el que las bacterias de suspensión, el tiempo de incubación de la bacteria en las características de gelatina mica recubierta de superficie, de la cepa bacteriana y el medio en el que las bacterias son expuestas. En general, el uso de la mica recubierta de gelatina resulta ser de aplicación general para las células microbianas de imágenes.

Viven las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas pueden ser inmovilizadas en gelatina mica recubierta y la imagen en el líquido utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

La AFM es una herramienta de obtención de imágenes de alta resolución (escala nm) que sondea mecánicamente una superficie. Tiene la capacidad de obtener imágenes de células y biomoléculas en un líquido...

La microscopía de fuerza atómica o un MFA utiliza la exploración mecánica de una superficie para generar imágenes de alta resolución sin necesidad de tratar químicamente la muestra. En este video, las bacterias se inmovilizan sobre mica recubierta con gelatina y se visualizan en un entorno líquido mediante un MFA. Primero, se cortan cuadrados de MICA para que encajen en la plataforma del microscopio de MFA. Se retira la capa superior de la MICA y los cuadrados de mica se recubren con gelatina.A continuación, se coloca una gota de suspensión bacteriana sobre la mica recubierta con gelatina y se extiende. Utilizando la punta de una pipeta, las muestras se incuban durante 10 minutos. Luego se lavan de la superficie las bacterias no unidas.La muestra se coloca en la celda húmeda de MF-A y se imagina para obtener imágenes de alta resolución de bacterias vivas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la movilización con filtro poroso ISO, es que tanto las bacterias con forma de bastón como las esféricas pueden inmovilizarse de manera confiable. Además, un mayor porcentaje de la superficie celular queda accesible para la sonda de MF-A.Una ventaja clave de la microscopía de fuerza atómica frente a otras microscopías es que se pueden realizar estudios en células individuales, permitiendo investigar la morfología celular, la formación del tabique y la citocinesis. Las personas nuevas en este método suelen tener dificultades porque tienden a usar gelatina que no ha demostrado inmovilizar bacterias, o bacterias cultivadas en medios complejos cuyos componentes compiten con la adhesión de las bacterias a la superficie de gelatina. Tuvimos la idea inicial de este método a partir de experimentos realizados en la década de 1970, en los que se inmovilizaban bacterias.Portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina para experimentos que utilizan microscopía óptica y auto radiografía. En esta demostración, se inmovilizan bacterias gramnegativas vivas para una imagenología de FM, aunque el método también es aplicable a bacterias grampositivas. Para preparar la MICA, comience por cortarla con tijeras para que se ajuste al portaobjetos del microscopio de FM y acomode la celda húmeda de FM.A continuación, coloque cinta adhesiva sobre la superficie de mica y retírela para desprender la capa externa de mica del trozo cortado. Continúe retirando la capa externa de ambos lados hasta que solo queden capas lisas e intactas. Para preparar la solución de gelatina, agregue 100 mililitros de agua destilada a un frasco de laboratorio y caliéntela en un microondas.Cuando el agua comience a hervir, retírela del microondas, agregue 0,5 gramos de gelatina y agite suavemente el frasco hasta que la gelatina se disuelva. Tenga en cuenta que las gelatinas bovinas no funcionan bien para este procedimiento. Se recomiendan las gelatinas porcinas.Coloque el frasco sobre la superficie de trabajo y déjelo enfriar hasta 60-70 grados Celsius. Luego, vierta una cantidad suficiente de la solución de gelatina en un vaso de precipitados pequeño para asegurar que la MICA pueda sumergirse completamente usando pinzas. Sumerja un cuadrado de MICA en la solución tibia de gelatina y retírelo rápidamente. Inmediatamente.Coloque la MICA de canto sobre una toalla de papel, apoyada contra una gradilla para microcentrífuga, y déjela secar al aire ambiente durante la noche. La MICA recubierta con gelatina puede utilizarse durante al menos dos semanas. Si la MICA recubierta con gelatina no se va a utilizar durante un par de semanas.Colóquelo sobre papel de filtro en una placa de Petri cubierta y guárdelo a temperatura ambiente. La solución excedente de gelatina puede conservarse refrigerada y utilizarse durante aproximadamente un mes, simplemente recalentando la solución stock a una temperatura entre 60 y 70 grados Celsius. Es necesario tener cuidado para asegurarse de que la gelatina no entre en ebullición durante el recalentamiento.Antes de montar las bacterias sobre MICA recubierta con gelatina, asegúrese de que la concentración bacteriana sea adecuada. Utilice un espectrofotómetro para obtener una lectura de densidad óptica de la muestra bacteriana a 600 nanómetros. Un OD de 0,5 a 1 es óptimo.A continuación, transfiera un mililitro de la cultura a un tubo microcentrífugo y centrifúguelo para formar el precipitado tras la centrifugación. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante, luego lave el precipitado con un mililitro de agua desionizada filtrada o tampón. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender.Reposar el precipitado, centrifugar su producto y resuspender inmediatamente el precipitado. En 500 microlitros de agua desionizada nano pura, la suspensión bacteriana debe ser visiblemente turbia para tener una concentración adecuada de células. Para una imagen de FM.Si existe preocupación por el choque osmótico, se puede agregar sacarosa 0,25 molar a la solución de imagen. He resuspendido esta bacteria en agua, pero no tenga miedo de probar otros líquidos. Por ejemplo, hemos realizado este procedimiento con sacarosa al 0,25 %, así que pruebe con otros líquidos y observe si también funcionan.Prepare dos portaobjetos para cada muestra. Utilizando una micropipeta, agregue de 10 a 20 microlitros de suspensión celular a la superficie recubierta con gelatina. Luego, para obtener un área de cobertura adecuada para la microscopía de FM, use la punta de una micropipeta para extender la gota en las direcciones X e Y.Teniendo cuidado de no tocar físicamente la superficie de gelatina con la punta de la pipeta, incube la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, enjuague con un chorro de agua y elimine el exceso de líquido tocando el borde de la muestra con una toalla de papel o papel de filtro. Seque rápidamente uno de los portaobjetos utilizando un chorro de gas nitrógeno.Luego inspeccione visualmente la lámina. Una mancha opaca indica que las bacterias no se eliminaron en el paso de lavado. La otra lámina, que ahora se utilizará para la obtención de imágenes, no debe dejarse secar.Colóquelo en la platina húmeda de la A FM y fíjelo utilizando las pinzas; con una pipeta micrométrica, agregue agua a la platina húmeda. Es recomendable preparar previamente el microscopio de fuerza atómica antes de realizar la imagen en líquido. Asegúrese de que el cantiléver para imagen en líquido esté colocado en la A FM y alineado con el láser.Continúe con la obtención de imágenes mediante microscopía de fuerza atómica utilizando un microscopio de fuerza atómica pico plus, equipado con una cabeza de escaneo de 100 micrones y sondas de nitruro de silicio vico con constantes elásticas nominales que varían entre 0,01 y 0,1 nano newton por nanómetro. Una vez que el microscopio esté preparado, inserte el escáner FM y la platina en el microscopio. Normalmente, comenzamos con una velocidad de imagen de 0,5 líneas por segundo hasta una línea por segundo, y la resolución se establece entre 128 puntos de datos por línea y 512.Configure el instrumento para adquirir imágenes utilizando de 128 a 512 píxeles por línea. Escanee a una velocidad de escaneo de 0,5 a una línea por segundo. Luego, si es necesario, ajuste el punto de ajuste y las ganancias en el A FM para obtener imágenes óptimas.Finalmente, recolecte las imágenes. Las bacterias E coli se montaron sobre MICA recubierta con gelatina según se describe en este video, y luego se imagaron en PVS 0,005 M. Utilizando este método.Los cilindros son claramente visibles en la imagen recopilada y las superficies celulares son lisas, sin mostrar signos de deshidratación. En comparación, las imágenes tomadas del mismo E. coli en aire, como se muestra aquí, a menudo revelan estructuras que no se observan en medio líquido. En este caso, las células presentan un aspecto anular debido a la deshidratación y pueden observarse apéndices bacterianos como las FIA.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras bacterianas para una imagenología de FM en un entorno líquido. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora si las microsuperficies recubiertas con gelatina ya han sido preparadas previamente. Al intentar este procedimiento, es importante elegir la gelatina correcta y tener una concentración adecuada de bacterias siguiendo este procedimiento.Otras mediciones, como el uso del cantiléver de FN como herramienta de detección de fuerza para obtener mediciones de fuerza en superficies bacterianas, pueden realizarse. Asimismo, se pueden anclar moléculas de sonda específicas a la punta de MF-A para que interactúen con blancos específicos en la superficie bacteriana, con el fin de identificar y medir las fuerzas de interacción. En general, no olvide que si está trabajando con bacterias patógenas, siempre deben tomarse precauciones al utilizar este método.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

La información espacio-temporal sobre las proteínas dinámicas dentro de las células vivas es crucial para entender la biología. Un tipo de microscopía de superresolución llamada microscopía rápida de iluminación estructurada en 3D (f3D-SIM) revela información única sobre el anillo Z citocinético en las bacterias: tanto su apariencia en forma de perla como la rápida dinámica de FtsZ dentro del anillo.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Se describe un sencillo procedimiento litográfico para la inmovilización de las moléculas de ADN del gen-longitud sobre una superficie, que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de expresión génica sin células en biochips.

Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.

Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

La microscopía de fuerza atómica-espectroscopía infrarroja (AFM-IR) proporciona una poderosa plataforma para estudios bacterianos, lo que permite lograr una resolución a nanoescala. Tanto el mapeo de los cambios subcelulares (por ejemplo, en la división celular) como los estudios comparativos de la composición química (por ejemplo, derivados de la resistencia a los medicamentos) se pueden realizar a nivel de una sola célula en bacterias.

Microscopía de Fuerza Atómica Combinada con Espectroscopía Infrarroja como Herramienta para Sondear Química de Bacteria Única

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Este estudio presenta un nuevo protocolo para aplicar directamente fuerza mecánica en el núcleo celular a través de microperlas magnéticas entregadas en el citoplasma y para realizar imágenes fluorescentes simultáneas de células vivas.

Combinación de actuador de fuerza magnética 3D e imágenes de fluorescencia multifuncionales para estudiar la mecanobiología del núcleo

Aquí, presentamos la aplicación de la microscopía de fuerza atómica (AFM) como un método simple y rápido para la caracterización bacteriana y analizamos detalles como el tamaño y la forma bacteriana, las biopelículas de cultivo bacteriano y la actividad de las nanopartículas como bactericidas.

Microscopía de fuerza atómica en modo de contacto como técnica rápida para la observación morfológica y el análisis del daño celular bacteriano

Presentamos un método simple y accesible para la visualización de cianobacterias filamentosas en el plano XY. Se utilizó una matriz de agarosa de bajo punto de fusión, que permite la adquisición de imágenes de proteínas implicadas en la división, en orientación vertical. Por lo tanto, esta metodología se puede aplicar a cualquier organismo filamentoso y diferentes tipos de proteínas.

Método de inmovilización vertical para el análisis de microscopía time-lapse en cianobacterias filamentosas

Aprende a inmovilizar bacterias vivas en mica recubierta con gelatina para microscopía de fuerza atómica en entorno líquido. Este método permite obtener imágenes de alta resolución de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas sin tratamiento químico.

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

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