Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica
August 10th, 2011
Viven las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas pueden ser inmovilizadas en gelatina mica recubierta y la imagen en el líquido utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM).
La microscopía de fuerza atómica o FM utiliza el sondeo mecánico de una superficie para generar imágenes de alta resolución sin la necesidad de tratar químicamente la muestra. En este video, las bacterias se inmovilizan en mica recubierta de gelatina y se obtienen imágenes en un entorno líquido mediante un FM. En primer lugar, se cortan los cuadrados MICA para adaptarse a la plataforma del microscopio A FM. Se retira la capa superior de la mica y los cuadrados de mica se recubren con gelatina.
A continuación, se coloca una gota de suspensión bacteriana sobre la mica recubierta de gelatina y se extiende. Con una punta de pipeta, las muestras se incuban durante 10 minutos. A continuación, las bacterias no unidas se lavan de la superficie.
La muestra se coloca en la celda húmeda A FM y se obtienen imágenes de alta resolución de bacterias vivas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la movilización de filtros porosos ISO, es que tanto las bacterias en forma de bastón como las esféricas se pueden inmovilizar de forma fiable. Además, un mayor porcentaje de la superficie de la celda es accesible para la sonda A FM.
Una ventaja clave de la microscopía de fuerza atómica sobre otras microscopías es que se pueden realizar estudios de células individuales, se pueden realizar investigaciones sobre la morfología celular, la formación del tabique y la citocinesis. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque tienden a usar gelatina que no está probada para inmovilizar bacterias o las bacterias usadas cultivadas en un medio complejo donde los componentes competirán con la adhesión de las bacterias a la superficie de la gelatina. La idea de este método fue a partir de experimentos en la década de 1970 en los que se inmovilizaban bacterias.
Portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina para experimentos con microscopía óptica y autorradiografía. En esta demostración, se inmovilizan bacterias gramnegativas vivas para una imagen FM, pero el método también es aplicable a bacterias grampositivas. Para preparar la MICA, comience cortándola con unas tijeras para que se ajuste a la platina del microscopio A FM y se adapte a la celda húmeda A FM.
A continuación, coloque cinta adhesiva sobre la superficie de MICA y retírela para despegar la capa exterior de MICA de la pieza cortada. Continúe retirando la capa exterior de ambos lados hasta que solo queden capas lisas e ininterrumpidas. Para preparar la solución de gelatina, agregue 100 mililitros de agua destilada a una botella de laboratorio y caliéntela en un microondas.
Cuando el agua empiece a hervir, retírala del microondas, añade 0,5 gramos de gelatina e hincha suavemente la botella hasta que la gelatina se disuelva. Tenga en cuenta que las gelatinas bovinas no funcionan bien para este procedimiento. Se recomiendan las gelatinas porcinas.
Coloque la botella en la mesa de trabajo y deje que se enfríe a 60 a 70 grados centígrados. A continuación, vierta una cantidad suficiente de la solución de gelatina en un vaso de precipitados pequeño para asegurarse de que la MICA pueda sumergirse completamente con pinzas. Sumerge un cuadrado de MICA en la solución de gelatina tibia y retíralo rápidamente. Inmediatamente.
Coloque la MICA en su borde sobre una toalla de papel apoyada contra una rejilla de microcentrífuga para que se seque al aire ambiente durante la noche. La MICA recubierta de gelatina se puede utilizar durante al menos dos semanas. Si la MICA está recubierta de gelatina, no se utilizará durante un par de semanas.
Colóquelo en papel de filtro en una placa de Petri cubierta y guárdelo a temperatura ambiente. El exceso de solución de gelatina se puede mantener refrigerado y utilizar durante aproximadamente un mes simplemente recalentando la solución madre entre 60 y 70 grados. Celsius se debe tener cuidado para asegurarse de que la gelatina no se hierva durante el recalentamiento.
Antes de montar las bacterias en MICA recubierto de gelatina, asegúrese de que la concentración bacteriana sea adecuada. Utilice un espectrofotómetro para obtener una lectura de densidad óptica de la muestra bacteriana a 600 nanómetros. Un OD de 0,5 a uno es óptimo.
A continuación, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo de microcentrífuga y centrífugue para pellet después de la centrifugación. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante, luego lave el pellet en un mililitro de agua desionizada filtrada o tampón. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para resus.
Suspenda el pellet, centrifugue su ganancia y vuelva a suspender el pellet de inmediato. En 500 microlitros de agua desionizada nano pura, la suspensión bacteriana debe estar visiblemente contaminada para tener una concentración adecuada de células. Para una imagen FM.
Si el choque osmótico es una preocupación, se puede agregar sacarosa 0.25 molar a la solución de imagen. He resuspendido esta bacteria en el agua, pero no tengas miedo de probar otros líquidos. Por ejemplo, hemos hecho esto con 0,25% de sacarosa, así que pruebe otros líquidos y vea si eso también funciona.
Prepare dos portaobjetos para cada muestra. Con una micropipeta, agregue de 10 a 20 microlitros de suspensión celular a la superficie recubierta de gelatina. A continuación, para proporcionar un área de cobertura adecuada para una imagen FM, utilice una punta de micropipeta para distribuir la gota tanto en la dirección X como en la Y.
Teniendo cuidado de no tocar físicamente la superficie de la gelatina con la punta de la pipeta, incube la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, enjuague con un chorro de agua y absorba el exceso de líquido de la muestra tocando el borde de la muestra con una toalla de papel o papel de filtro. Seque rápidamente uno de los portaobjetos con un chorro de gas nitrógeno.
A continuación, inspeccione visualmente la diapositiva. Una mancha opaca indica que las bacterias no se eliminaron en el paso de lavado. El otro portaobjetos, que ahora se utilizará para la toma de imágenes, no debe dejarse secar.
Colóquelo en la etapa húmeda A FM y asegúrelo con los clips, con una micropipeta agregue agua a la etapa húmeda. Es una buena idea preparar el microscopio de fuerza atómica antes de tomar imágenes en líquido. Asegúrese de que el voladizo para la obtención de imágenes en líquido esté colocado en el A FM y esté alineado con el láser.
Proceda con la obtención de imágenes por microscopía de fuerza atómica utilizando un microscopio de fuerza atómica pico plus, equipado con un cabezal de escaneo de 100 micras y sondas de nitruro de silicio vico con constantes de resorte nominales que oscilan entre 0,01 y 0,1 nano newton por nanómetro. Una vez que el microscopio esté preparado, inserte el escáner FM y la platina en el microscopio. Por lo general, comenzamos con 0,5 líneas por segundo hasta una línea por segundo, ya que nuestra velocidad de imagen y la resolución se establecen desde 1 28 puntos de datos por línea hasta 512.
Configure el instrumento para capturar imágenes utilizando de 128 a 512 píxeles por línea. Escanee a una velocidad de escaneo de 0,5 a una línea por segundo. Luego, si es necesario, ajuste el punto de ajuste y las ganancias en el A FM para lograr imágenes óptimas.
Por último, recoge las imágenes. Las bacterias E. coli se montaron en MICA recubierta de gelatina como se describe en este video, y luego se obtuvieron imágenes en PVS de 0,005 molares. Usando este método.
Los cetros son claramente visibles en la imagen recopilada y las superficies de las células son lisas, sin mostrar signos de deshidratación. En comparación, las imágenes tomadas de la misma E. coli en el aire como se muestra aquí, a menudo muestran estructuras que no se ven en el líquido. En este caso, las células muestran un aspecto de anillo debido a la deshidratación y se pueden ver apéndices bacterianos como FIA.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar muestras bacterianas para una imagen FM en un entorno líquido. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si las microsuperficies recubiertas de gelatina se han preparado previamente en la cama. Al intentar este procedimiento, es importante elegir la gelatina correcta y tener una concentración adecuada de bacterias después de este procedimiento.
Se pueden realizar otras mediciones, como el uso del voladizo FN como herramienta de detección de fuerza para retener las mediciones de fuerza en superficies bacterianas. Además, las moléculas específicas de la sonda se pueden atar a la punta A FM para interactuar con objetivos específicos en la superficie bacteriana para identificar y medir las fuerzas de interacción. En general, no olvide que si está trabajando con bacterias patógenas, siempre se deben tomar precauciones cuando se trabaja con este método.
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Visión general
Este estudio demuestra el uso de la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) para inmovilizar e imagenar bacterias Gram negativas y Gram positivas vivas en un entorno líquido. El método implica recubrir mica con gelatina para facilitar la adhesión y visualización bacteriana.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Técnicas de imagen
- Microscopía de Fuerza Atómica
Antecedentes
- La Microscopía de Fuerza Atómica permite la obtención de imágenes de superficies de alta resolución.
- Las bacterias vivas pueden ser difíciles de estudiar debido a su movimiento.
- Las superficies recubiertas de gelatina pueden mejorar la inmovilización bacteriana.
- La obtención de imágenes en entornos líquidos preserva el estado natural de las bacterias.
Propósito del estudio
- Demostrar un método para inmovilizar bacterias en una superficie.
- Visualizar bacterias usando AFM sin tratamiento químico.
- Proporcionar un protocolo para investigadores interesados en la imagen bacteriana.
Métodos utilizados
- Se cortan cuadrados de mica y se recubren con gelatina.
- Se aplica una gota de suspensión bacteriana a la superficie de gelatina.
- Las muestras se incuban para permitir que las bacterias se adhieran.
- Las bacterias no unidas se lavan antes de obtener las imágenes.
Principales resultados
- Las bacterias vivas fueron inmovilizadas exitosamente en mica recubierta de gelatina.
- Se obtuvieron imágenes de alta resolución de bacterias usando AFM.
- El método permite la obtención de imágenes en un entorno líquido.
- Ambas bacterias Gram negativas y Gram positivas fueron visualizadas.
Conclusiones
- Este método proporciona una forma confiable para estudiar bacterias vivas.
- La AFM puede ser usada efectivamente para la obtención de imágenes de muestras biológicas.
- Son posibles más aplicaciones en microbiología y técnicas de imagen.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy enables high-resolution imaging of live bacteria in liquid environments without chemical fixation, preserving native morphology and physiological state. This capability supports early-stage target validation by allowing direct observation of bacterial surface structures, division events, and membrane dynamics under near-native conditions. The gelatin-coated mica immobilization method provides a reproducible, minimally invasive platform for microbiological imaging that reduces sample preparation artifacts and enhances data reliability in discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of bacterial morphology, septum formation, and cytokinesis to interrogate therapeutic hypotheses about cell division targets.
- Operational Value: Provides label-free, liquid-phase imaging that avoids fixation artifacts and preserves functional bacterial attributes for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Gelatin-coated mica creates a standardized, reusable surface for consistent bacterial immobilization across screening campaigns.
- Operational Value: Supports preparation of validated biological systems with high surface accessibility for AFM probe interaction, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by imaging live bacteria in liquid, maintaining disease-relevant system integrity.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through quantitative, reproducible morphological and topological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a standardized preparation step for live bacterial imaging, supporting hypothesis testing and biological de-risking before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct imaging of cell surface dynamics and division events in liquid.
- Screening: Enables assay readiness via reproducible bacterial immobilization on gelatin-coated mica, ensuring consistent sample presentation for AFM analysis.
- Analytics: Generates high-resolution topographical and force measurements that allow comparison of bacterial conditions, treatments, or genetic modifications.
- Translational Research: Maintains continuity with preclinical work by preserving native bacterial state in liquid, avoiding artifacts from fixation or dehydration.
- Enterprise Reuse: Gelatin-coated mica substrates can be prepared in advance and stored for up to two weeks, enabling platform reuse across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free observation of bacterial ultrastructure.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined immobilization protocols, gelatin source specifications (porcine), and concentration controls (OD 0.5–1.0).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative morphological data that reduces late-stage biological risk in antimicrobial or antibacterial programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through standardized, scalable imaging outputs that enable cross-functional comparison of antibacterial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, liquid-cell imaging, and bacterial handling under aseptic conditions.
- Depends on access to AFM systems with liquid cells, silicon nitride probes, and environmental control for scan speed and resolution.
- Necessitates standardization of gelatin preparation (porcine, 0.5% in distilled water), mica preparation, and bacterial concentration (OD 0.5–1.0 at 600 nm) across teams.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, media components, and imaging buffers (e.g., sucrose addition for osmotic sensitivity).
- Limited by the need to avoid gelatin boiling during preparation and potential interference from complex media components that compete with bacterial adhesion to gelatin.
