Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica
10 de agosto de 2011
Viven las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas pueden ser inmovilizadas en gelatina mica recubierta y la imagen en el líquido utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM).
La microscopía de fuerza atómica o un MFA utiliza la exploración mecánica de una superficie para generar imágenes de alta resolución sin necesidad de tratar químicamente la muestra. En este video, las bacterias se inmovilizan sobre mica recubierta con gelatina y se visualizan en un entorno líquido mediante un MFA. Primero, se cortan cuadrados de MICA para que encajen en la plataforma del microscopio de MFA. Se retira la capa superior de la MICA y los cuadrados de mica se recubren con gelatina.
A continuación, se coloca una gota de suspensión bacteriana sobre la mica recubierta con gelatina y se extiende. Utilizando la punta de una pipeta, las muestras se incuban durante 10 minutos. Luego se lavan de la superficie las bacterias no unidas.
La muestra se coloca en la celda húmeda de MF-A y se imagina para obtener imágenes de alta resolución de bacterias vivas. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la movilización con filtro poroso ISO, es que tanto las bacterias con forma de bastón como las esféricas pueden inmovilizarse de manera confiable. Además, un mayor porcentaje de la superficie celular queda accesible para la sonda de MF-A.
Una ventaja clave de la microscopía de fuerza atómica frente a otras microscopías es que se pueden realizar estudios en células individuales, permitiendo investigar la morfología celular, la formación del tabique y la citocinesis. Las personas nuevas en este método suelen tener dificultades porque tienden a usar gelatina que no ha demostrado inmovilizar bacterias, o bacterias cultivadas en medios complejos cuyos componentes compiten con la adhesión de las bacterias a la superficie de gelatina. Tuvimos la idea inicial de este método a partir de experimentos realizados en la década de 1970, en los que se inmovilizaban bacterias.
Portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina para experimentos que utilizan microscopía óptica y auto radiografía. En esta demostración, se inmovilizan bacterias gramnegativas vivas para una imagenología de FM, aunque el método también es aplicable a bacterias grampositivas. Para preparar la MICA, comience por cortarla con tijeras para que se ajuste al portaobjetos del microscopio de FM y acomode la celda húmeda de FM.
A continuación, coloque cinta adhesiva sobre la superficie de mica y retírela para desprender la capa externa de mica del trozo cortado. Continúe retirando la capa externa de ambos lados hasta que solo queden capas lisas e intactas. Para preparar la solución de gelatina, agregue 100 mililitros de agua destilada a un frasco de laboratorio y caliéntela en un microondas.
Cuando el agua comience a hervir, retírela del microondas, agregue 0,5 gramos de gelatina y agite suavemente el frasco hasta que la gelatina se disuelva. Tenga en cuenta que las gelatinas bovinas no funcionan bien para este procedimiento. Se recomiendan las gelatinas porcinas.
Coloque el frasco sobre la superficie de trabajo y déjelo enfriar hasta 60-70 grados Celsius. Luego, vierta una cantidad suficiente de la solución de gelatina en un vaso de precipitados pequeño para asegurar que la MICA pueda sumergirse completamente usando pinzas. Sumerja un cuadrado de MICA en la solución tibia de gelatina y retírelo rápidamente. Inmediatamente.
Coloque la MICA de canto sobre una toalla de papel, apoyada contra una gradilla para microcentrífuga, y déjela secar al aire ambiente durante la noche. La MICA recubierta con gelatina puede utilizarse durante al menos dos semanas. Si la MICA recubierta con gelatina no se va a utilizar durante un par de semanas.
Colóquelo sobre papel de filtro en una placa de Petri cubierta y guárdelo a temperatura ambiente. La solución excedente de gelatina puede conservarse refrigerada y utilizarse durante aproximadamente un mes, simplemente recalentando la solución stock a una temperatura entre 60 y 70 grados Celsius. Es necesario tener cuidado para asegurarse de que la gelatina no entre en ebullición durante el recalentamiento.
Antes de montar las bacterias sobre MICA recubierta con gelatina, asegúrese de que la concentración bacteriana sea adecuada. Utilice un espectrofotómetro para obtener una lectura de densidad óptica de la muestra bacteriana a 600 nanómetros. Un OD de 0,5 a 1 es óptimo.
A continuación, transfiera un mililitro de la cultura a un tubo microcentrífugo y centrifúguelo para formar el precipitado tras la centrifugación. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante, luego lave el precipitado con un mililitro de agua desionizada filtrada o tampón. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender.
Reposar el precipitado, centrifugar su producto y resuspender inmediatamente el precipitado. En 500 microlitros de agua desionizada nano pura, la suspensión bacteriana debe ser visiblemente turbia para tener una concentración adecuada de células. Para una imagen de FM.
Si existe preocupación por el choque osmótico, se puede agregar sacarosa 0,25 molar a la solución de imagen. He resuspendido esta bacteria en agua, pero no tenga miedo de probar otros líquidos. Por ejemplo, hemos realizado este procedimiento con sacarosa al 0,25 %, así que pruebe con otros líquidos y observe si también funcionan.
Prepare dos portaobjetos para cada muestra. Utilizando una micropipeta, agregue de 10 a 20 microlitros de suspensión celular a la superficie recubierta con gelatina. Luego, para obtener un área de cobertura adecuada para la microscopía de FM, use la punta de una micropipeta para extender la gota en las direcciones X e Y.
Teniendo cuidado de no tocar físicamente la superficie de gelatina con la punta de la pipeta, incube la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, enjuague con un chorro de agua y elimine el exceso de líquido tocando el borde de la muestra con una toalla de papel o papel de filtro. Seque rápidamente uno de los portaobjetos utilizando un chorro de gas nitrógeno.
Luego inspeccione visualmente la lámina. Una mancha opaca indica que las bacterias no se eliminaron en el paso de lavado. La otra lámina, que ahora se utilizará para la obtención de imágenes, no debe dejarse secar.
Colóquelo en la platina húmeda de la A FM y fíjelo utilizando las pinzas; con una pipeta micrométrica, agregue agua a la platina húmeda. Es recomendable preparar previamente el microscopio de fuerza atómica antes de realizar la imagen en líquido. Asegúrese de que el cantiléver para imagen en líquido esté colocado en la A FM y alineado con el láser.
Continúe con la obtención de imágenes mediante microscopía de fuerza atómica utilizando un microscopio de fuerza atómica pico plus, equipado con una cabeza de escaneo de 100 micrones y sondas de nitruro de silicio vico con constantes elásticas nominales que varían entre 0,01 y 0,1 nano newton por nanómetro. Una vez que el microscopio esté preparado, inserte el escáner FM y la platina en el microscopio. Normalmente, comenzamos con una velocidad de imagen de 0,5 líneas por segundo hasta una línea por segundo, y la resolución se establece entre 128 puntos de datos por línea y 512.
Configure el instrumento para adquirir imágenes utilizando de 128 a 512 píxeles por línea. Escanee a una velocidad de escaneo de 0,5 a una línea por segundo. Luego, si es necesario, ajuste el punto de ajuste y las ganancias en el A FM para obtener imágenes óptimas.
Finalmente, recolecte las imágenes. Las bacterias E coli se montaron sobre MICA recubierta con gelatina según se describe en este video, y luego se imagaron en PVS 0,005 M. Utilizando este método.
Los cilindros son claramente visibles en la imagen recopilada y las superficies celulares son lisas, sin mostrar signos de deshidratación. En comparación, las imágenes tomadas del mismo E. coli en aire, como se muestra aquí, a menudo revelan estructuras que no se observan en medio líquido. En este caso, las células presentan un aspecto anular debido a la deshidratación y pueden observarse apéndices bacterianos como las FIA.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras bacterianas para una imagenología de FM en un entorno líquido. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora si las microsuperficies recubiertas con gelatina ya han sido preparadas previamente. Al intentar este procedimiento, es importante elegir la gelatina correcta y tener una concentración adecuada de bacterias siguiendo este procedimiento.
Otras mediciones, como el uso del cantiléver de FN como herramienta de detección de fuerza para obtener mediciones de fuerza en superficies bacterianas, pueden realizarse. Asimismo, se pueden anclar moléculas de sonda específicas a la punta de MF-A para que interactúen con blancos específicos en la superficie bacteriana, con el fin de identificar y medir las fuerzas de interacción. En general, no olvide que si está trabajando con bacterias patógenas, siempre deben tomarse precauciones al utilizar este método.
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Resumen
Este estudio demuestra el uso de la microscopía de fuerza atómica (AFM) para inmovilizar y obtener imágenes de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas vivas en un entorno líquido. El método consiste en recubrir la mica con gelatina para facilitar la adhesión bacteriana y la visualización.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Microbiología
- Técnicas de Imagen
- Microscopía de Fuerza Atómica
Antecedentes
- La microscopía de fuerza atómica permite obtener imágenes de superficies con alta resolución.
- Estudiar bacterias vivas puede ser difícil debido a su movimiento.
- Las superficies recubiertas con gelatina pueden mejorar la inmovilización bacteriana.
- La obtención de imágenes en entornos líquidos preserva el estado natural de las bacterias.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método para inmovilizar bacterias sobre una superficie.
- Visualizar bacterias mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) sin tratamiento químico.
- Proporcionar un protocolo para investigadores interesados en el análisis de imágenes bacterianas.
Métodos Utilizados
- Se cortan cuadrados de mica y se recubren con gelatina.
- Se aplica una gota de suspensión bacteriana sobre la superficie de gelatina.
- Las muestras se incuban para permitir la adhesión de las bacterias.
- Las bacterias no unidas se eliminan mediante lavado antes de la obtención de imágenes.
Resultados principales
- Se inmovilizaron con éxito bacterias vivas sobre mica recubierta con gelatina.
- Se obtuvieron imágenes de alta resolución de bacterias utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM).
- El método permite la obtención de imágenes en un entorno líquido.
- Se visualizaron bacterias tanto Gram-negativas como Gram-positivas.
Conclusiones
- Este método proporciona una manera confiable para estudiar bacterias vivas.
- La FMA puede utilizarse eficazmente para obtener imágenes de muestras biológicas.
- Son posibles aplicaciones adicionales en microbiología y técnicas de imagen.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía de fuerza atómica permite la obtención de imágenes de alta resolución de bacterias vivas en ambientes líquidos sin fijación química, preservando la morfología nativa y el estado fisiológico. Esta capacidad facilita la validación temprana de objetivos al permitir la observación directa de estructuras superficiales bacterianas, eventos de división y dinámicas de membrana en condiciones casi nativas. El método de inmovilización sobre mica recubierta con gelatina proporciona una plataforma reproducible y mínimamente invasiva para la obtención de imágenes microbiológicas que reduce los artefactos de preparación de muestras y mejora la fiabilidad de los datos en flujos de trabajo de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la visualización directa de la morfología bacteriana, la formación del septo y la citocinesis para investigar hipótesis terapéuticas sobre dianas de la división celular.
- Valor operativo: Proporciona imágenes sin marcadores en fase líquida que evitan artefactos por fijación y preservan los atributos funcionales bacterianos para la desviación mecanicista de riesgos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: La mica recubierta con gelatina crea una superficie estandarizada y reutilizable para la inmovilización bacteriana consistente en campañas de cribado.
- Valor operativo: Permite la preparación de sistemas biológicos validados con alta accesibilidad de superficie para la interacción con la sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM), posibilitando la evaluación confiable de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la obtención de imágenes de bacterias vivas en estado líquido, manteniendo la integridad del sistema relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante lecturas cuantitativas y reproducibles de parámetros morfológicos y topológicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar un paso estandarizado de preparación para la imagenología de bacterias vivas, apoyando la prueba de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos antes de las etapas de identificación de compuestos prometedores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la obtención directa de imágenes de la dinámica de la superficie celular y los eventos de división en medio líquido.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la inmovilización reproducible de bacterias sobre mica recubierta con gelatina, asegurando una presentación consistente de las muestras para el análisis mediante microscopía de fuerza atómica (AFM).
- Análisis: Genera mediciones topográficas y de fuerza de alta resolución que permiten comparar condiciones bacterianas, tratamientos o modificaciones genéticas.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad con trabajos preclínicos al preservar el estado nativo de las bacterias en medio líquido, evitando artefactos derivados de la fijación o deshidratación.
- Reutilización Empresarial: Los sustratos de mica recubiertos con gelatina pueden prepararse con antelación y almacenarse hasta por dos semanas, lo que posibilita la reutilización de la plataforma en múltiples proyectos y equipos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la observación directa y sin marcadores de la ultraestructura bacteriana.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos definidos de inmovilización, especificaciones de la fuente de gelatina (porcina) y controles de concentración (OD 0,5–1,0).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos morfológicos cuantitativos que reducen el riesgo biológico en fases avanzadas de programas antimicrobianos o antibacterianos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante resultados de imagen estandarizados y escalables que permiten la comparación interdisciplinaria de candidatos antibacterianos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo del microscopio de fuerza atómica (AFM), en imágenes con celda líquida y en el manejo de bacterias bajo condiciones asépticas.
- Depende del acceso a sistemas de AFM con celdas líquidas, sondas de nitruro de silicio y control ambiental para la velocidad y resolución del escaneo.
- Necesita la estandarización de la preparación de gelatina (porcina, 0.5% en agua destilada), la preparación de mica y la concentración bacteriana (OD 0.5–1.0 a 600 nm) entre diferentes equipos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes cepas bacterianas, componentes del medio y tampones de imagen (por ejemplo, la adición de sacarosa para la sensibilidad osmótica).
- Está limitado por la necesidad de evitar la ebullición de la gelatina durante su preparación y por la posible interferencia de componentes complejos del medio que compiten con la adhesión bacteriana a la gelatina.
