Name: Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a detectar virus infecciosos en mosquitos de campo mediante ensayo de cultivo celular Vero. Este método permite identificar diversidad viral en vectores y mejorar la vigilancia epidemiológica.

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Agradecemos la importante contribución de los Dres. John Anderson, Andrew principal y Shirley Tirrell a este estudio. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (U50/CCU116806-01-1) y el Departamento de Agricultura de EE.UU. (58-6615-1-218, CONH00768 y CONH00773).

1. Mosquito clasificación e identificación <ol><li> Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un banco de laboratorio abierto en una dedicada nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) de laboratorio por personal capacitado para trabajar con los mosquitos viven. Una &quot;cadena de frío&quot; se mantiene durante todo el procedimiento. </li><li> Anestesiar a vivir los mosquitos adultos mediante la colocación de bolsa de recolección de mosquitos en un congelador de -20 º durante 5 minutos. Transferencia de bolsa de recolección de un recipiente aislado que contiene hielo seco. Cierre la tapa y exponer a los mosquitos a los de dióxido de carbono durante 1-3 minutos para asegurar la completa precipitación. </li><li> Toque mosquitos anestesiados en una sartén previamente enfriado colocado sobre una cama de hielo seco. Separado los mosquitos individuales femeninos con unas pinzas finas y colóquelas en tazas de parte de plástico. Cubrir con tazas de tapa y coloque en hielo. </li><li> Identificar los mosquitos de las especies mediante claves taxonómicas descriptivo basado en la morfología externa de mosquitos con la ayuda de un microscopio de disección estéreo (10-60X de zoom) montado sobre una mesa chill electrónico. </li><li> Combine identificado especies de mosquitos en las piscinas de ≤ 50 personas en 2 ml tapa complemento viales que contienen una BB de cobre. Los viales están etiquetados con un identificador único. </li><li> Tras la identificación de todos los mosquitos, los viales se colocan en bolsas etiquetadas y se mantiene en un refrigerador de espuma de poliestireno que contengan hielo seco. </li><li> Tienda de criaderos de mosquitos en un congelador -80 ° C hasta que las pruebas del virus. </li></ol> 2. Bioseguridad consideraciones de aislar el virus de los mosquitos <ol><li> Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en una de bioseguridad de nivel 3 (BSL-3) por el personal de laboratorio que están capacitados para trabajar en este nivel de contención 1. Las instalaciones de laboratorio, equipos, procedimientos y prácticas están sujetas a la supervisión institucional, estatal y federal y la inspección. Buscar la formación adecuada y aprobación antes de intentar los siguientes protocolos. </li><li> Use el equipo de protección personal (PPE) para cada procedimiento, tales como batas desechables, guantes, protectores faciales y respiradores. </li><li> Desinfectar las superficies de trabajo con el 70% de alcohol antes y después de completar los procedimientos. </li><li> Cultivos celulares y el material potencialmente infeccioso se manejan en un gabinete de bioseguridad clase II (BSC). </li><li> Criaderos de mosquitos se homogeneizan en un mezclador de molino que se coloca dentro de un BSC. </li><li> Homogeneizados de los mosquitos se centrifugan en una microcentrífuga hermética a los aerosoles. Si este procedimiento no puede llevarse a cabo dentro de un BSC, el operador debe usar un respirador al manejar y recuperar muestras de la centrífuga. </li><li> Pipetas y puntas de pipeta de manejo de materiales en el BSC (gabinete de bioseguridad) se sumergen en lejía al 10% antes de la esterilización en autoclave. Todos los desechos de laboratorio es descontaminado en autoclave antes de su eliminación. </li></ol> 3. Preparación de las células Vero <ol><li> Los medios de comunicación decantar la cultura de un frasco grande de cultivo de tejidos (175 cm 2) de las células Vero confluentes (clon E6) en el vaso los residuos que contengan lejía. </li><li> Lavar las células Vero mediante la adición de una alícuota de 5 ml de PBS y agitar sobre la capa de células ya lo largo de los lados del frasco, asegurándose de cubrir bien toda la monocapa. </li><li> PBS se decanta en el vaso de residuos. </li><li> Añadir 2,5 ml de tripsina-EDTA y se arremolinan sobre la capa de células asegurándose de cubrir bien toda la monocapa. </li><li> Incubar frasco en la incubadora durante 5 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Agite con cuidado y el matraz agitar para eliminar las células de la superficie inferior. Las células se deslice con facilidad; incubar un adicional de 1-5 minutos si las células no son fáciles de deslizar. </li><li> Añadir 5 ml de medio mínimo esencial (MEM), 5% de suero fetal bovino (SFB), utilizando una pipeta serológica y pipeta hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces a disolver los grumos de células. </li><li> Añadir otros 15 ml de MEM, 5% de SFB para un volumen total de 22,5 ml y mezclar bien. </li><li> Lugar 40 frascos pequeños de cultivo de tejidos (25 cm 2) en posición vertical en dos bastidores (20 frascos / rack). </li><li> Coloque los bastidores que contienen frascos dentro de la cabina de bioseguridad y de remover las tapas frasco, colocar las tapas directamente en frente de los frascos. </li><li> Prescindir de 4 ml de MEM, 5% de SFB en cada frasco con una pipeta serológica. </li><li> Coloque 0.5 ml de células suspendidas en cada frasco (~ 1:06 relación de división) Vuelva a colocar las tapas matraz. </li><li> Agregar 50 ml de MEM, 5% de SFB al original frasco grande de cultivo de tejidos que contienen la suspensión de células restantes (~ 2,5 mL) y el retorno frasco a la incubadora. El mismo frasco grande de cultivo de tejidos puede ser reutilizado hasta 5 pasos y luego un nuevo frasco debe ser puesta en marcha en su lugar. </li><li> La cultura el lugar de tejido pequeños frascos apilados en la bandeja. Remolino de la bandeja para asegurarse de que los medios de comunicación de manera uniforme cubre la parte inferior del matraz. </li><li> Colocar frascos pequeños en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 y crecer durante la noche hasta el 80-90% confluente. </li></ol> 4. Preparación de los criaderos de mosquitos <ol><li> Mantener criaderos de mosquitos frío durante los procedimientos de prueba. El uso de pre-enfriadobastidores congelador y cassettes molino mezclador, reactivos helada, y una centrífuga refrigerada en el tratamiento de criaderos de mosquitos. </li><li> Se colocan los tubos que contienen los mosquitos en un estante del congelador antes de la helada y añadir 1 a 1,5 ml de PBS-G a cada tubo de mosquitos. </li><li> Recuperar molino mezclador-cassettes del congelador. Lugar 24 tubos en cada cinta y luego se asegura en el mezclador de molino. </li><li> Homogeneizar las muestras durante 4 minutos a 25 ciclos / segundo. El molino mezclador sacude los tubos a alta velocidad y una BB de metal dentro de cada tubo altera el tejido del mosquito. </li><li> Tubos centrífuga durante 6 minutos a 7.000 rpm. </li><li> Se colocan los tubos de nuevo en el congelador hasta bastidores inoculados en células Vero. </li></ol> 5. La inoculación de células Vero con homogeneizados de pool de mosquitos <ol><li> Marcar al menos una frasco de cultivo de tejidos de cada serie en microscopio invertido para asegurar la salud adecuada confluencia y celular; esperar cerca de 80-90% de cobertura. </li><li> Línea hasta 20 frascos pequeños de cultivo de tejidos en un rack y frascos con números de adhesión correspondientes de cada grupo de mosquitos. </li><li> Afloje las tapas y la mayoría se decanta de los medios de comunicación de los frascos de cultivo de tejidos en el vaso de residuos. Deje suficiente material en el recipiente por completo monocapa de células abrigo. </li><li> 100μL alícuota del sobrenadante de cada grupo de mosquitos procesados ​​en el matraz de cultivo de tejidos correspondientes. </li><li> Vuelva a colocar y apretar la tapa cultura matraz. </li><li> Coloque los frascos de cultivo plano en agitador durante 5 minutos (temperatura ambiente) a 35-40 rpm. </li><li> Retorno del 20 frascos de cultivo de tejidos a la posición vertical en un rack y el lugar en el BSC. </li><li> Destapando tres frascos de cultivo de tejido al mismo tiempo, prescindir de cuatro medios de cultivo mL en cada frasco con una pipeta serológica, recoloque las tapas. </li><li> Asegúrese de que la punta de la pipeta no hace contacto con el cuello del matraz la cultura o el labio. Cambie la punta de la pipeta cuando sea necesario si se hace contacto con el frasco. </li><li> Incubar frascos de cultivo de tejidos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 6. Revisión de células Vero para el crecimiento de virus <ol><li> Pantalla inoculados frascos de cultivo de tejidos en busca de signos de infección viral, el efecto citopático (CPE), a partir de 3-7 días después de la inoculación. </li><li> Inspeccione visualmente los cultivos celulares para la CPE y / o contaminación por la inclinación de los frascos y examinar los medios de comunicación que las piscinas en la parte inferior del frasco. Los medios de comunicación van a aparecer nubes que las células se deterioran durante el CPE o debido al crecimiento de las levaduras, hongos, o la contaminación bacteriana. </li><li> Volver a examinar cultivos celulares que muestran los medios de comunicación nublado bajo un microscopio invertido. Los virus causan que las células se deforman y se desatará a partir de los frascos de cultivo. Cultivos celulares con contaminantes visibles, la levadura, por ejemplo, otras bacterias, hongos o restos de mosquitos pesados, son de nuevo a prueba al pasar la piscina mosquito original a través de un filtro de jeringa 0.22μM. </li><li> Asépticamente prescindir de 1.2 mL de los medios de comunicación de virus de los cultivos celulares positivos en criotubos etiquetados con una pipeta serológica. </li><li> Cultivos de virus se almacenan a -80 ° C hasta el momento identificados por las pruebas de diagnóstico apropiadas. </li></ol> 7. Preparación de los reactivos <ol><li> MEM, el 5% de SFB. Disolver 37,6 g de MEM en polvo en un volumen final de 4 litros de dd H 2 0. Prescindir de solución en 500 ml de alícuotas en frascos de medios de comunicación y autoclave. Cuando la solución se haya enfriado, añadir asépticamente 26 mL inactivado por calor suero fetal bovino, 5,2 mL L-glutamina, 5,2 anti-biotic/mycotic ml, y 10,4 ml de 7,5% de bicarbonato de sodio a cada botella. Almacenar a 4 ° C. </li><li> PBS-G. Disolver 16 g de NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g de Na 2 HPO 4, 0,4 g de KH 2 PO 4, y 4 ml de 0,5% de rojo fenol en 1000 ml dd H 2 0. Ajustar el pH a 7,1-7,4 con NaOH 2 N (si es necesario). En un vaso separado, el calor 600 ml de H 2 0 a hervir. Eliminar de la placa caliente, agregar 10 g de gelatina y disolver. Añadir la solución de la gelatina disuelta a la solución de PBS y ajustar el volumen final de 2 L con dd H 2 O. Vierta 100 ml de solución en botellas y autoclave. Cuando la solución se haya enfriado, añadir asépticamente 42,8 ml de suero inactivado por calor conejo y 1,4 mL anti-biotic/mycotic. Almacenar a 4 ° C. </li><li> De lavado PBS celular. Agregar 50 ml de 10X Dulbecco PBS a 400 ml dd H 2 O. Ajustar el pH a 7.1 con NaOH 2N. Ajustar el volumen final de 500 ml con dd H 2 O. Filtrar la solución con la unidad de 0.2uM filtro de vacío. Se distribuye en alícuotas de 5 ml en 8 ml con tapa de rosca tubos. Almacenar a 4 ° C. </li></ol> 8. Resultados representante Nueve diferentes de virus a partir de 4 familias taxonómicas fueron recuperados de los mosquitos recolectados durante la vigilancia continua del estado de Connecticut 1997 a 2010 (cuadro 1). Cinco de estos virus causan enfermedad en humanos, los patógenos más importantes son el virus del Nilo y la encefalitis equina del este virus. Los nuevos descubrimientos son: el primer aislamiento del virus del Nilo Occidental de los mosquitos recolectados enAmérica del Norte en 1999 2, el primer aislamiento del virus de Potosí, en el noreste de EE.UU. en 2000 3, y el primer aislamiento del virus La Crosse en Nueva Inglaterra en 2005 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Familia </td><td> N º cepas </td><td> No. localidades </td><td> Número de años en detectarse </td><td> Las enfermedades humanas </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Virus del Nilo Occidental </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Moderada a severa, fiebre, encefalitis </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Equina del este virus de la encefalitis </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Encefalitis severa, </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J virus </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> No se conoce </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Canyon virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> De leve a moderado, fiebre, meningitis </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Potosí virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> No se conoce </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> De leve a severa, fiebre, las enfermedades neurológicas en los dos casos documentados </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> No se conoce </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse virus </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Moderada a severa encefalitis, </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flandes virus </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> No se conoce </td><td></td></tr></tbody></table> Los virus Tabla 1. Detectado en mosquitos recolectados en campo por el ensayo de cultivo de células Vero. Los mosquitos fueron colectados durante la vigilancia a nivel estatal en Connecticut 1997 a 2.010.

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<li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes%2C+crows%2C+and+a+Cooper%27s+hawk+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+collected+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+%28Bunyaviridae%29+isolated+from+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li>
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<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+%28Bunyaviridae%3A+Orthobunyavirus%29+from+field-collected+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+ten-year+analysis%2C+1997-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li>
<li>Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaty%2C+BJ+%22Diagnostic+Procedures+for+Viral%2C+Rickettsial%2C+and+Chlamydial+Infections%22">Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections</a>. , American Public Health Association. 189-212 (1995).</li>
<li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarabatsos%2C+N+%22International+Catalogue+of+Arboviruses+Including+Certain+Other+Viruses+of+Vertebrates%22">International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates</a>. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).</li>
<li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens%2C+field-collected+mosquitoes%2C+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li>
<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

De células Vero ensayo de cultivo sirve como un método eficaz para los mosquitos pantalla de campo recogidos por la diversidad de virus. Esto contrasta con los métodos moleculares que apuntan específicamente a uno o unos pocos virus de interés. Por otra parte, hemos encontrado que la prueba de cultivo celular Vero es, si no también más sensible que la RT-PCR 7 y nos proporciona cepas de virus que se almacenan en nuestra colección de referencia para futuros estudios. Sin embargo, los sistemas de cultivo celula...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> De bicarbonato de sodio NaHCO3, 7,5% sol.. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutamina 200 mM 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Polvo medio mínimo esencial (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10 veces más de Dulbecco PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Suero de conejo </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Las células Vero (clon E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Pequeños frascos de cultivo de tejidos, tapones ventilados, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Grandes frascos de cultivo de tejidos, tapones ventilados, de 175 cm2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> De cobre recubierto de BB, de 4,5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mixer Mill </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> IsoPack bastidores congelador </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular vero

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Los mosquitos transmiten una serie de virus distintos incluyendo importantes patógenos humanos, tales como virus del Nilo Occidental, el virus del dengue y el virus de chickungunya. Muchos de estos virus se han intensificado en sus rangos endémica y se expandió a nuevos territorios, que requieren de programas efectivos de vigilancia y control para responder a estas amenazas. Una estrategia para controlar la actividad del virus consiste en recolectar una gran cantidad de mosquitos de los sitios endémicos y ponerlos a prueba para la infección viral. En este artículo se describe cómo manipular, transformar, y la pantalla de campo recogidos por los mosquitos del virus infeccioso por el ensayo de cultivo de células Vero. Los mosquitos son ordenados por ubicación trampa y especies, y se agrupan en las piscinas que contienen ≤ 50 personas. Muestras agrupadas se homogeneizan en solución salina usando un mezclador de molino y la fase acuosa se inocula en cultivos de células Vero confluentes (clon E6). Los cultivos celulares son monitoreados por efecto citopático a partir de 3-7 días después de la inoculación y cualquier tipo de virus en cultivos celulares son identificados por los ensayos de diagnóstico apropiadas. Mediante la utilización de este enfoque, hemos aislado nueve virus distintos de los mosquitos recolectados en Connecticut, EE.UU., y entre ellos, 5 son conocidos por causar enfermedades humanas. Tres de estos virus (virus del Nilo Occidental, el virus de Potosí y La Crosse virus) representan nuevos registros para América del Norte o de la región de Nueva Inglaterra desde 1999. La capacidad de detectar una amplia variedad de virus es fundamental para control establecidos y los virus de reciente aparición en la población de mosquitos.

Se describe un método para procesar y la pantalla de campo recogidos mosquitos para una diversidad de virus mediante el ensayo de cultivo de células Vero. Mediante el empleo de esta técnica, hemos detectado nueve virus distintos de 4 familias taxonómicas de mosquitos recogidos en Connecticut.

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Los mosquitos transmiten diversos virus, incluidos patógenos humanos importantes como el virus del Nilo Occidental, el virus del dengue y el virus del chikungunya. Muchos...

El objetivo general de este procedimiento es cribar mosquitos recolectados en el campo para detectar infecciones virales mediante un ensayo de cultivo celular en células Vero. Primero, los mosquitos recolectados en el campo se clasifican según la especie. Luego, los mosquitos se homogenizan utilizando un molino mezclador.Una vez preparados los homogenatos de mosquitos, se cultivan células Vero en previsión de las pruebas virales; luego, cada cultivo de células Vero se inocula con un único homogenato de mosquito, se coloca en un agitador durante cinco minutos y se incuba a 37 grados Celsius para permitir la propagación de los virus. Finalmente, los cultivos se examinan visualmente en busca de evidencia de efectos citopáticos inducidos por virus. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la R-T-P-C-R es que permite cribar mosquitos en busca de una amplia diversidad de agentes virales que crecen en cultivo celular.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la entomología médica, como los roles que desempeñan diferentes especies de mosquitos en la transmisión de virus. Utilice una instalación de nivel de bioseguridad dos para el siguiente procedimiento. Coloque la bolsa de recolección que contiene mosquitos vivos a menos 20 grados Celsius durante 15 minutos para anestesiarlos.Una vez que los insectos estén anestesiados, transfiera la bolsa a un recipiente aislado que contenga hielo seco y exponga a los mosquitos al dióxido de carbono durante uno a tres minutos para asegurar una inmovilización completa. A continuación, coloque los mosquitos sobre una bandeja previamente enfriada sobre una cama de hielo seco. Utilizando pinzas de punta fina, identifique los insectos hembras y transfiéralos a vasos plásticos individuales.Las hembras pueden distinguirse de los machos examinando las piezas bucales y las antenas. Selle los recipientes y colóquelos sobre hielo húmedo. Utilice un microscopio estereoscópico de disección montado sobre una mesa electrónica refrigerada y una clave taxonómica.Identifique la especie de cada grupo de mosquitos, agrupando los mosquitos de la misma especie en viales etiquetados de dos mililitros con tapa de rosca que contengan una bola de cobre. Hasta 50 individuos pueden agruparse en un solo tubo a medida que se llenan. Coloque los viales en bolsas etiquetadas dentro de un recipiente de espuma de poliestireno sobre hielo seco.Una vez que todos los mosquitos hayan sido identificados, pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta la homogenización. Utilice una instalación de nivel de bioseguridad tres para este procedimiento y trabaje dentro de una cabina de bioseguridad clase dos. Añada aproximadamente un mililitro de PBSG por tubo y coloque los tubos que contienen mosquitos dentro de una cinta de molino mezclador previamente enfriada.Sujete el casete cargado en un molino mezclador y homogenice los grupos de mosquitos durante cuatro minutos a 25 ciclos por segundo. Una vez homogeneizados los mosquitos, transfiera los tubos a una microcentrífuga refrigerada hermética al aerosol y centrifugue. El homogeneizado de mosquitos a 7.000 RPM durante seis minutos.Los tubos tras la centrifugación se pueden almacenar a menos 80 grados Celsius hasta la prueba del virus. Vierta el medio de cultivo de un matraz T175 de células de cría confluentes en un vaso de desecho que contenga lejía. Añada cinco mililitros de PBS al matraz y lave las células uniformemente antes de verter el PBS en el vaso de desecho.Después de lavar las células, agregue 2.5 mililitros de tripsina-EDTA e incube el frasco a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante cinco minutos para desprender las células. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue cinco mililitros de MEM y pipetee las células hacia arriba y hacia abajo varias veces para romper cualquier agregado. Luego agregue otros 15 mililitros de MEM.Coloque 40 matraces T 25 en dos rejillas dentro de la cabina de seguridad biológica y retire las tapas de los matraces, colocándolas directamente frente a cada matraz. Utilizando una pipeta estéril, alícuote cuatro mililitros de MEM en cada matraz. A continuación, agregue 0,5 mililitros de células vari en suspensión y tape los matraces. Apile los matraces sobre una bandeja y agítelos suavemente para asegurarse de que el medio cubra uniformemente el fondo de los matraces.Incube los cultivos a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante la noche o hasta que las células alcancen una confluencia del 80 al 90%. Retire 20 frascos pequeños del incubador y etiquételos con el número de acceso correspondiente de cada grupo de mosquitos. Vierta cuidadosamente la mayor parte del medio de cada frasco en el recipiente de desecho, dejando solo la cantidad suficiente de medio para recubrir la monocapa celular.Transfiera 100 microlitros de sobrenadante de cada homogenato de mosquito a los frascos etiquetados correspondientes y selle los frascos firmemente. Una vez transferidos los sobrenadantes, coloque los frascos en un agitador ajustado a 35-40 RRP M durante cinco minutos. Regrese los frascos a la cabina de seguridad biológica y agregue cuatro mililitros de medio de crecimiento a cada uno.Cierre los frascos y colóquelos a incubar a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante tres a siete días. Una vez que los cultivos estén listos para ser analizados, primero inspeccione visualmente el medio. Un medio turbio indica efectos citopáticos inducidos por virus o contaminación con otros microorganismos, o ambas cosas; examine los cultivos que presenten medio turbio bajo un microscopio óptico invertido.Los virus suelen provocar que las células se deformen y se desprendan de los frascos de cultivo. Si se detecta contaminación con bacterias, levaduras o hongos, o si el cultivo contiene abundantes restos de mosquitos, vuelva a analizar el grupo original de mosquitos tras filtrarlo a través de una jeringa de 0,22 micrones. Filtre y distribuya asépticamente uno o dos mililitros de medio de cultivos positivos para virus y no contaminados con otros microorganismos en tubos criogénicos etiquetados.Almacene las muestras que contienen virus a menos 80 grados Celsius hasta su identificación, utilizando los ensayos diagnósticos apropiados con este ensayo. Se recuperaron nueve tipos diferentes de virus pertenecientes a cuatro familias taxonómicas a partir de mosquitos recolectados en Connecticut durante un período continuo de vigilancia estatal desde 1997 hasta 2010. Varios de estos virus, incluidos el virus de la encefalitis equina del este y el virus del Nilo Occidental, son conocidos por causar enfermedades en humanos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo clasificar, procesar y tamizar mosquitos para detectar infección viral mediante el ensayo de cultivo celular viral.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

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