Las nanopartículas fluorescentes para la Medición de la concentración de iones en sistemas biológicos

El objetivo general del siguiente experimento consiste en fabricar nanosensores de sodio para aplicaciones in vitro e in vivo. Esto se logra preparando una mezcla óptica que contiene los componentes del sensor para los nanosensores. Como segundo paso, se sonicó el surfactante en solución acuosa para distribuirlo uniformemente, lo que permitirá la formación de nanosensores cuando se añada la mezcla óptica.

A continuación, se añade la mezcla opto a la mezcla acuosa de tensioactivo bajo sonicación para formar los nanosensores en solución. Este video demuestra que la respuesta del sensor es ajustable. Los sensores pueden inyectarse por microinyección en miocitos cardíacos y también pueden inyectarse por vía subcutánea en ratones.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los colorantes indicadores fluorescentes es que podemos ajustar los sensores a un rango dinámico que coincida con el entorno fisiológico, medir un rango más amplio de analitos y realizar mediciones ratiométricas para análisis cuantitativos. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque, una vez fabricados los sensores, puede parecer intimidante introducirlos en un entorno biológico. Es necesario preparar por anticipado los stocks de ion seco de sodio cuatro x, TFPB sódico seco y chromo cuatro tres antes de fabricar el opto, según el protocolo escrito.

En una campana extractora, combine todos los materiales en un vial de vidrio de 1,5 mililitros. Con un tapón roscado recubierto de teflón, vortex suavemente el vial hasta que todo el PVC se haya disuelto. La solución debe presentar un color rojo.

Comience a preparar los nanosensores añadiendo 100 microlitros de 10 miligramos por mililitro de lípido Peg a un vial de vidrio de cuatro gramos. A continuación, agregue cuatro mililitros de la solución acuosa deseada, como 10 milimolar de hippies.

Sincronice una punta agitadora siete milímetros dentro del vial utilizando un elevador de laboratorio y aplique una potencia baja de sonicación durante 30 segundos. En un tubo de 0,6 mililitros, combine 50 microlitros del material óptico y 50 microlitros de diclorometano utilizando la pipeta para asegurar una mezcla uniforme. A continuación, inicie una sonicación de tres minutos.

Al comenzar la sonicación, agregue 100 microlitros de la mezcla opto sumergiendo la punta de la pipeta y dispensando todo el volumen en una sola inyección rápida y uniforme. La solución se volverá azul si el pH aumenta por encima de siete, y si no hay sodio para eliminar el THF residual y el metileno dicloruro de la solución. Mueva la punta del sonicador a una profundidad de dos milímetros.

Mientras transcurren los tres minutos restantes, la solución se volverá opaca. Una vez finalizada la sonicación, aspire la solución de nanosensor en una jeringa de cinco mililitros. Coloque un filtro y vierta la solución de nanosensor en un vial de vidrio con tapa de rosca.

Comience preparando 10 soluciones con concentraciones de sodio progresivamente crecientes frente a las cuales se puede medir la sensibilidad del nanosensor. Combine soluciones stock de sodio de cero molar y un molar en tubos cónicos de 50 mililitros. Ahora, en una placa óptica de 96 pozos, agregue 100 microlitros de cada concentración de sodio a tres pozos en una columna.

Luego, agregue 100 microlitros de nanosensores recién preparados a cada pocillo, cargue la placa en un fluorímetro de microplacas e introduzca las longitudes de onda de excitación, emisión y corte que sean ideales para el cromóforo que se esté utilizando. La elección de las longitudes de onda medidas depende de la aplicación. Estas longitudes de onda permiten mediciones intracelulares de dinámicas rápidas o la reducción de ruido.

Para obtener los valores alfa, divida la relación de intensidad a 570 nanómetros por la intensidad a 670 nanómetros o 680 nanómetros. Represente gráficamente los valores alfa frente al logaritmo de la concentración de sodio. Establezca el logaritmo de concentración cero de sodio en menos uno.

Ahora ajuste una curva sigmoidea a la respuesta y, a partir de la curva, calcule la concentración de sodio en la que el valor alfa es 0,5. Esto representa la concentración de sodio en la que el sensor responde de manera óptima. Utilizando esta información, ajuste la relación de ionóforo de sodio IV, TFPB de sodio y cromo ionóforo III en el optodo para crear nanosensores con la concentración óptima de sodio.

Por ejemplo, curvas de respuesta de heroína de cinco conjuntos diferentes de nanosensores que representan distintas formulaciones ópticas, que varían únicamente en la cantidad de sodio de cuatro 10. Para imágenes intracelulares, reemplace el medio celular con un medio transparente como la solución de Tyro y transfiera las células a una cámara de imagen. Ahora, rellene desde atrás una pipeta de vidrio estirada con la solución de nanosensor preparada en cinco miligramos por mililitro de glucosa en agua.

Luego monte la pipeta en un micromanipulador y conéctela a un sistema de inyección controlado por presión. Baje la pipeta sobre la célula y dentro del citoplasma. A veces es necesario golpear suavemente el soporte del manipulador para perforar la membrana.

Inyecte unas pocas cientos de picolitros de solución de nanosensor e retire rápidamente la pipeta. Anestesie un ratón CD-1 hembra con isoflurano utilizando una cámara de anestesia. Una vez anestesiado, coloque al ratón en una cámara de imagenología desinfectada.

A continuación, llene una jeringa de insulina estéril de calibre 31 con 10 microlitros de nanosensores con el KD adecuado en PBS 10 milimolar. Asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire utilizando pinzas. Sujete un pequeño pliegue de piel a lo largo de la espalda del ratón en el sitio de inyección deseado mientras sostiene la piel.

Introduzca la jeringa en la piel con el bisel hacia arriba y la aguja paralela a la piel. Ahora tire suavemente del émbolo de la jeringa para asegurarse de que la aguja no se ha insertado en un vaso sanguíneo. Para minimizar la presión contraria, mueva suavemente la aguja hacia la derecha y la izquierda para crear un bolsillo dentro de la piel.

Luego inyecte los sensores y retire suavemente la jeringa. Aplique presión suavemente sobre el sitio de inyección y limpie cualquier solución que pueda haberse filtrado por el sitio de inyección. Por lo general, se realizan seis inyecciones espaciadas uniformemente a lo largo de la espalda.

Si se realiza en diferentes ratones, cambie la aguja para minimizar la transmisión de enfermedades y la contaminación cruzada. Después de las inyecciones, obtenga imágenes de campo claro y fluorescentes utilizando conjuntos de filtros que coincidan estrechamente con el espectro de emisión de excitación de los nanosensores. Esto también minimiza la autofluorescencia de la piel.

Estos miocitos cardíacos neonatales se cultivaron sobre un cubreobjetos e inyectaron con nanosensores de sodio. Esta imagen fluorescente se obtuvo con una longitud de onda de excitación de 639 nanómetros. Esta es una imagen de campo brillante de las mismas células, y esta es una superposición de ambas.

Existe cierta agrupación de sensores, pero las células presentan morfología normal. Los sensores se han difundido por todo el citosol y no hay carga nuclear. Esta superposición de una imagen de campo brillante y una imagen fluorescente muestra nueve inyecciones subcutáneas diferentes de nanosensores de sodio en el espacio subcutáneo de un ratón desnudo.

Una vez que Masten fabrica nanosensores, la elaboración puede completarse en minutos si se realiza correctamente, y puede aplicarse a cualquier investigación para medir el flujo reversible de analitos en tiempo real. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cargar nanosensores en el espacio intracelular o subcutáneo para realizar mediciones cuantitativas en un entorno biológico.