Los polímeros con memoria de forma para el cultivo celular activo

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células en un sustrato con una topografía que cambia con el tiempo. Esto se logra programando primero un polímero con memoria de forma en una forma permanente que pueda ser recordada. A continuación, el polímero con memoria de forma se programa en una forma temporal en la que se colocan posteriormente las células.

El paso final del procedimiento es activar el polímero con memoria de forma para que vuelva a su forma permanente aumentando la temperatura, finalmente se pueden obtener resultados que muestran un cambio en el comportamiento celular a través de la microscopía de fluorescencia. Hola, mi nombre es Pat Mather. Soy profesor de ingeniería biomédica y química y director del Instituto de Biomateriales de Syracuse aquí en la Universidad de Syracuse.

La principal ventaja de esta técnica sobre los aparatos comerciales o personalizados para estirar células es que en un solo sistema polimérico, podemos aplicar una amplia variedad de cepas complejas a las células. Mi nombre es Jay Henderson. Soy profesor asistente de Ingeniería Biomédica y Química y miembro del Instituto de Biomateriales de Syracuse.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecanobiología, como la forma en que las células responden a los cambios dinámicos en su entorno físico. Mi nombre es Kevin Davis y soy estudiante de doctorado en la Universidad de Syracuse en el Departamento de Ingeniería Biomédica e Ingeniería Química. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología mecánica en 2D, también se puede utilizar para otros sistemas, como los andamios de cambio de forma en 3D para la ingeniería de tejidos.

Antes del inicio de este procedimiento, prepare una cámara de curado personalizada utilizando un portaobjetos de vidrio, un espaciador de teflón de un milímetro de grosor y una placa de aluminio. Asegure la cámara con pequeños clips de aglutinante para comenzar, inyecte NOA 63 en la cámara a través de un orificio en el espaciador de teflón con una aguja de calibre 18. A continuación, coloque la cámara en una placa calefactora a 125 grados centígrados.

Deje que la cámara se caliente a una temperatura uniforme durante cinco minutos después del calentamiento de la cámara. Adquiera el NOA 63 durante 20 minutos colocando una lámpara UV a 6,5 centímetros de la superficie del vidrio. Retire el NOA 63 de la cámara mientras aún está caliente con una cuchilla de afeitar.

A continuación, poscurar el polímero con memoria de forma bajo la luz ultravioleta durante tres horas y 40 minutos directamente sobre la placa calefactora a 125 grados centígrados. Para caracterizar la memoria de forma del NOA 63, prepare una muestra de mancuerna presionando en caliente la película curada con un punzón personalizado. Finalmente, deteste el espécimen en un analizador mecánico dinámico con dispositivo de tracción.

Configure el instrumento para forzar el modo controlado y programe el procedimiento de prueba como se encuentra en el protocolo escrito que acompaña a este video. El resultado del procedimiento es un polímero con memoria con forma de curado isotérmico o una película SMP que coloca CSMP en una placa caliente y establece la temperatura más alta que la temperatura de transición vítrea para reducir el módulo y facilitar el corte. Para preparar muestras individuales a partir de la película s y p curada isotérmicamente.

Corte la película s y p con una navaja hasta el tamaño de muestra deseado. La forma temporal se puede fijar de varias maneras diferentes. Aquí. Se utiliza una prensa hidráulica de sobremesa con placas que se pueden calentar y enfriar para estampar una topografía temporal.

Primero, ajuste la temperatura de los PLA a una temperatura superior a la tg. Para esta demostración, se fabricó un estampador curando epoxi en un disco de vinilo para producir una forma temporal de ranuras paralelas. La gofradora puede estar hecha de otros materiales y con diferentes topografías, pero debe ser más rígida que la NOA 63.

A la temperatura de estampado, coloque las muestras s y p boca abajo en la gofradora. A continuación, coloque las muestras y la gofradora en la prensa. Aplique una precarga de aproximadamente 100 kilos de pascales para hacer contacto entre los PLA de calentamiento y las muestras se mantienen durante unos cinco minutos para permitir que las muestras alcancen una temperatura uniforme.

Una vez que se alcance una temperatura uniforme, aplique de uno a seis megapascales a las muestras y manténgalo durante un minuto. La SMP se fracturará. Si se aplica una tensión mayor.

Aplique tensiones más pequeñas para introducir topografías con amplitudes más pequeñas. Después de aplicar presión, reduzca la temperatura por debajo del TG utilizando la capacidad de enfriamiento por agua de los plaats de la prensa. Cuando la temperatura esté por debajo de la tg, elimine la fuerza aplicada antes de comenzar el experimento de cultivo celular activo.

La luz ultravioleta de la cabina de seguridad biológica se utiliza para esterilizar las muestras. Coloque las muestras boca abajo en platos estériles sin tapa y encienda la luz ultravioleta durante seis horas. A continuación, voltee las muestras a nuevos platos estériles en posición boca arriba.

Encienda la luz ultravioleta durante seis horas más. Las muestras deben equilibrarse a un estado relativamente estable antes de sembrar con las células. Coloque las muestras en una placa de 96 pocillos y agregue 150 microlitros de crecimiento completo.

Medio por pocillo. Colocar la placa en una incubadora a 30 grados centígrados con 5%CO2 hasta alcanzar la recuperación parcial deseada. Para esta demostración, las muestras se incuban durante 30 horas para producir una amplitud lo suficientemente grande como para alinear las células.

Una vez que se logra la recuperación parcial, las muestras se pueden sembrar con células. Coloque las muestras en una nueva placa de 96 pocillos. A continuación, añada 150 microlitros de solución celular a cada una de las muestras de aquí, C3 H 10 t y medio.

La mayoría de los fibroblastos embrionarios se utilizan a 20.000 células por mililitro. Para lograr células aisladas, permita que las células se adhieran y se propaguen en la topografía temporal incubando a 30 grados centígrados durante 9,5 horas. A continuación, ensaye la morfología celular antes de la transición mediante la extracción de muestras y la realización de imágenes de tinción y fluorescencia de las muestras.

Este material exhibe autofluorescencia a través de la mayor parte de los rayos UV y los cuatro fluorados de rango visible en el extremo rojo lejano del espectro, como Alexa Fluor 6 47, se recomiendan para reducir el fondo para desencadenar la recuperación de las muestras, mover la placa a una incubadora de 37 grados Celsius y continuar el cultivo durante 19 horas. Esto permite que el material se recupere y las células adapten su morfología a la nueva topografía. Después de la incubación, aplique los tintes adecuados, como la fallina para la obtención de imágenes de actina filamentosa.

Como paso final, las células se pueden visualizar en la nueva topografía que se muestra aquí es la memoria de forma unidireccional a granel de una sola cura NOA 63. Se repite tres veces donde el asterisco indica curado de inicio experimental. NOA 63 es un sólido transparente y vítreo que tiene excelentes propiedades de memoria de forma.

En este caso, el material fue curado y muestra un TG uniforme de 51,1 grados Celsius determinado desde el inicio de la caída del módulo de almacenamiento. La caída de la deformación que se observa aquí se produce en la tg medida. Un gran porcentaje de la deformación aplicada al 4,7% se fijó después de descargar a 20 grados centígrados, lo que corresponde a una relación de fijación del 89,3%La deformación fija se recuperó a una relación del 84,4% en un rango de temperatura relativamente pequeño durante el calentamiento.

El rendimiento de la memoria de forma no mostró deterioro hasta tres ciclos, como lo demuestra el hecho de que todas las curvas siguieron casi exactamente el mismo camino. La amplitud de la topografía temporal disminuye con el tiempo a 30 grados centígrados en 30 horas. A 30 grados centígrados.

La amplitud se ha reducido en aproximadamente un 50%, indicado aquí en el tiempo cero. Se reduce otro 10% durante las siguientes 9,5 horas. Cuando la recuperación se desencadena aumentando la temperatura a 37 grados centígrados, la amplitud se reduce al 0,5% de la amplitud inicial en 9,5 horas para el impresor utilizado y una tensión de estampado de 4,9 megapascales.

Esto corresponde a un cambio funcional de ranuras de 13 micrómetros a una superficie casi plana. Este polímero se recupera en el rango de temperatura de 30 a 37 grados en condiciones de cultivo celular. Esto se debe a la absorción de agua del medio de cultivo, el plástico de agua dimensiona el polímero, lo que reduce la tg, lo que permite la recuperación a temperaturas por debajo del TG seco de 51 grados.

Un ejemplo de un comportamiento celular controlado mediante el uso de sustratos activos de cultivo celular es un cambio en la organización del citoesqueleto en sustratos ranurados temporales. Antes de que se desencadene la recuperación, los microfilamentos de actina se alinean a lo largo de la dirección de las ranuras. Después de la recuperación por el aumento de temperatura, los microfilamentos se han reorganizado y se orientan aleatoriamente.

Por el contrario, las muestras de control que tienen ranuras estáticas, planas o estáticas no se reorganizan después del aumento de la temperatura. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la geometría de la cámara de curado, la temperatura de transición del polímero, el método de fijación de la deformación y la composición del polímero en sí se pueden ajustar para lograr la transición deseada en su propio experimento siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la PCR en tiempo real, se pueden utilizar para responder a preguntas adicionales, como cómo cambia la expresión génica en respuesta a la estimulación mecánica del sustrato después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la mecanobiología celular investigaran la física del citoesqueleto celular, el reordenamiento y la materia blanda en dos dimensiones. Gracias por su interés en nuestro trabajo y gracias por mirar.