Los polímeros con memoria de forma para el cultivo celular activo

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células en un sustrato con una topografía que cambie con el tiempo. Esto se logra primero programando un polímero con memoria de forma en una forma permanente que puede recordarse. Luego, el polímero con memoria de forma se programa en una forma temporal sobre la cual posteriormente se siembran las células.

El paso final del procedimiento consiste en activar el polímero con memoria de forma para que regrese a su forma permanente aumentando la temperatura; finalmente se pueden obtener resultados que muestran un cambio en el comportamiento celular mediante microscopía de fluorescencia. Hola, me llamo Pat Mather. Soy profesor de ingeniería biomédica y química y director del Instituto de Biomateriales Syracuse en la Universidad de Syracuse.

La principal ventaja de esta técnica frente a dispositivos comerciales o personalizados para estirar células radica en que, mediante un único sistema polimérico, podemos aplicar una amplia variedad de tensiones complejas a las células. Mi nombre es Jay Henderson. Soy profesor asistente de Ingeniería Biomédica y Química y miembro del Instituto de Biomateriales de Syracuse.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mecanobiología, como la forma en que las células responden a los cambios dinámicos en su entorno físico. Mi nombre es Kevin Davis y soy estudiante de doctorado en la Universidad de Syracuse, en el Departamento de Ingeniería Biomédica e Ingeniería Química. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología mecánica en 2D, también puede utilizarse en otros sistemas, como andamios tridimensionales que cambian de forma para la ingeniería de tejidos.

Antes de comenzar este procedimiento, prepare una cámara de curado personalizada utilizando una lámina de vidrio, un espaciador de teflón de un milímetro de grosor y una placa de aluminio. Sujete la cámara con pequeños clips sujetapapeles al principio, inyecte NOA 63 en la cámara a través de un orificio en el espaciador de teflón utilizando una aguja de calibre 18. A continuación, coloque la cámara en una placa calefactora ajustada a 125 grados Celsius.

Deje que la cámara se caliente a una temperatura uniforme durante cinco minutos tras el calentamiento de la cámara. Adquiera el NOA 63 durante 20 minutos colocando una lámpara UV a 6,5 centímetros de la superficie del vidrio. Retire el NOA 63 de la cámara mientras aún esté caliente utilizando una cuchilla de afeitar.

Luego, realice un post-curado del polímero con memoria de forma bajo luz UV durante tres horas y 40 minutos directamente sobre la placa calefactora a 125 grados Celsius. Para caracterizar la memoria de forma del NOA 63, prepare un espécimen en forma de figura de ocho mediante prensado en caliente de la película curada con un punzón personalizado. Finalmente, coloque el espécimen en un analizador mecánico dinámico con accesorio de tracción.

Configure el instrumento en modo controlado por fuerza y programe el procedimiento de prueba según se indica en el protocolo escrito que acompaña a este video. El resultado del procedimiento es un polímero con memoria de forma curado isotérmicamente o película de SMP. Coloque el CSMP en una placa calefactora y ajuste la temperatura por encima de la temperatura de transición vítrea para reducir el módulo y facilitar el corte. Para preparar muestras individuales a partir de la película de S y P curada isotérmicamente.

Corte la película s y p con una cuchilla al tamaño deseado de la muestra. La forma temporal puede fijarse de varias maneras diferentes. Aquí, se utiliza una prensa hidráulica de banco con placas que pueden calentarse y enfriarse para estampar una topografía temporal.

Primero, ajuste la temperatura de los PLA a un valor superior al tg. Para esta demostración, se fabricó un grabado curando epoxi sobre un disco de vinilo para producir una forma temporal de surcos paralelos. El grabado puede elaborarse con otros materiales y diferentes topografías, pero debe ser más rígido que el NOA 63.

Coloque las muestras s y p a temperatura de estampado boca abajo sobre el estampador. Luego introduzca las muestras y el estampador en la prensa. Aplique aproximadamente 100 kilopascales de precarga para lograr el contacto entre las placas calefactoras y las muestras, y mantenga durante unos cinco minutos para permitir que las muestras alcancen una temperatura uniforme.

Una vez alcanzada una temperatura uniforme, aplique de uno a seis megapascales a las muestras y mantenga durante un minuto. El SMP se fracturará. Si se aplica un esfuerzo mayor.

Aplique tensiones más pequeñas para introducir topografías con amplitudes menores. Después de aplicar la presión, reduzca la temperatura por debajo de la TG utilizando la capacidad de enfriamiento por agua de la prensa plaats. Cuando la temperatura esté por debajo de la tg, retire la fuerza aplicada antes de comenzar el experimento de cultivo celular activo.

La luz UV del gabinete de seguridad biológica se utiliza para esterilizar las muestras. Coloque las muestras boca abajo en placas estériles sin tapa y encienda la luz UV durante seis horas. Luego, dé la vuelta a las muestras y colóquelas en placas estériles nuevas en posición boca arriba.

Encienda la luz UV durante seis horas adicionales. Las muestras deben equilibrarse a un estado relativamente estable antes de sembrarlas con células. Coloque las muestras en una placa de 96 pocillos y agregue 150 microlitros de medio de crecimiento completo.

Medio por pocillo. Coloque la placa en un incubador a 30 grados Celsius con 5% de CO2 hasta alcanzar la recuperación parcial deseada. Para esta demostración, las muestras se incuban durante 30 horas para producir una amplitud suficientemente grande como para alinear las células.

Una vez lograda la recuperación parcial, las muestras pueden ser sembradas con células. Coloque las muestras en una nueva placa de 96 pocillos. Luego agregue 150 microlitros de solución celular a cada una de las muestras aquí, C3 H 10 t y medio.

La mayoría de los fibroblastos embrionarios se utilizan a 20.000 células por mililitro. Para obtener células aisladas, permita que las células se adhieran y se extiendan sobre la topografía temporal incubando a 30 grados Celsius durante 9,5 horas. A continuación, analice la morfología celular antes de la transición retirando muestras y realizando tinción e imágenes de fluorescencia de las muestras.

Este material presenta autofluorescencia en la mayor parte del rango ultravioleta y visible; se recomiendan fluoróforos en el extremo rojo lejano del espectro, como Alexa Fluor 647, para reducir el fondo. Para inducir la recuperación de las muestras, traslade la placa a un incubador a 37 grados Celsius y continúe el cultivo durante 19 horas. Esto permite que el material se recupere y que las células adapten su morfología a la nueva topografía. Tras la incubación, aplique los colorantes adecuados, como faloidina para la visualización de actina filamentosa.

Como paso final, las células pueden ser observadas mediante imágenes en la nueva topografía mostrada aquí, que corresponde a la recuperación de forma monodireccional masiva tras una única cura de NOA 63. Se repitió tres veces, donde el asterisco indica el inicio experimental curado. NOA 63 es un sólido transparente y vítreo que posee excelentes propiedades de memoria de forma.

En este caso, el material fue curado y muestra una temperatura de transición vítrea (TG) uniforme de 51,1 grados Celsius, determinada a partir del inicio de la caída del módulo de almacenamiento. La disminución de la deformación observada aquí ocurre a la tg medida. Un porcentaje elevado del 4,7 % de deformación aplicada se fijó tras la descarga a 20 grados Celsius, lo que corresponde a una relación de fijación del 89,3 %. La deformación fijada se recuperó entonces en un 84,4 % dentro de un rango de temperatura relativamente pequeño durante el calentamiento.

El rendimiento del efecto memoria de forma no mostró deterioro hasta tres ciclos, como lo demuestran todas las curvas que siguen prácticamente el mismo recorrido. La amplitud de la topografía temporal disminuye con el tiempo a 30 grados Celsius en 30 horas. A 30 grados Celsius.

La amplitud se ha reducido aproximadamente en un 50 %, indicado aquí en el tiempo cero. Se reduce otro 10 % en las siguientes 9,5 horas. Cuando la recuperación se desencadena aumentando la temperatura a 37 grados Celsius, la amplitud se reduce al 0,5 % de la amplitud inicial dentro de las 9,5 horas para el embossador utilizado y un esfuerzo de embossado de 4,9 megapascales.

Esto corresponde a un cambio funcional de surcos de 13 micrómetros a una superficie casi plana. Este polímero se recupera en el rango de temperatura de 30 a 37 grados bajo condiciones de cultivo celular. Esto se debe a la absorción de agua del medio de cultivo, el agua plastifica el polímero, lo que reduce la tg, permitiendo la recuperación a temperaturas por debajo de la tg seca de 51 grados.

Un ejemplo de un comportamiento celular controlado mediante el uso de sustratos activos de cultivo celular es un cambio en la organización del citoesqueleto sobre sustratos ranurados temporales. Antes de que se desencadene la recuperación, los filamentos de actina se alinean a lo largo de la dirección de las ranuras. Después de la recuperación mediante un aumento de temperatura, los filamentos microscópicos se han reorganizado y presentan una orientación aleatoria.

Por el contrario, las muestras de control que tienen superficies estáticas, planas o con surcos estáticos no se reorganizan tras el aumento de temperatura. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la geometría de la cámara de curado, la temperatura de transición del polímero, el método de fijación de la deformación y la composición del propio polímero pueden ajustarse todos para lograr la transición deseada en su propio experimento siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la PCR en tiempo real, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como cómo cambia la expresión génica en respuesta a la estimulación mecánica del sustrato tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la mecanobiología celular estudiaran el citoesqueleto celular, el reordenamiento y la física de la materia blanda en dos dimensiones. Gracias por su interés en nuestro trabajo y por ver este video.