Name: Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Aprende a fabricar biosensores electroquímicos de ADN para detectar ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas en matrices biológicas complejas como sangre y suero.

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Este trabajo fue financiado por una subvención (OPP1015402) de la Fundación Bill y Melinda Gates a través de la Iniciativa de Exploraciones de Grandes Desafíos, y por el NIH a través de subvenciones GM062958-01 y 2R01EB002046. Este trabajo fue realizado, en parte, bajo los auspicios del Departamento de Energía de EE.UU. por el Lawrence Livermore National Laboratory bajo el contrato DE-AC52-07NA27344.

1. Preparando el escenario <ol><li> Compra el ADN correspondiente, sin modificar químicamente la sonda de una empresa de oligonucleótidos de síntesis a medida tales como las tecnologías Biosearch (Novato, CA) o Certificado de Midland (Midland, TX). La sonda se modifica durante la síntesis de la adición de un tiol C6 en su extremo 3 'y un azul de metileno redox-activa en su extremo 5'. </li><li> Disolver el ADN de la sonda en tampón fosfato salino pH 7,4 a una concentración de 200 mM y verificar su concentración midiendo su absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro. Debido a la mitad de azul de metileno en la sonda de ADN, la solución debe tener un tinte azul visible. </li><li> Recién preparar 1 ml de una solución 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP en agua destilada, desionizada (DI-agua). En nuestra experiencia, estas soluciones TCEP se mantienen frescos durante una semana cuando se almacena en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Para reducir los puentes disulfuro que pueden estar presentes en la solución de ADN de la sonda, combine 1 l de la solución de la sonda de valores de ADN con 2 l de la solución TCEP y mezclar suavemente con una pipeta. Incubar la mezcla durante una hora en un recipiente oscuro, refrigerados. La solución inicialmente azul debe quedar claro que el TCEP reversible reduce el azul de metileno. Si la solución no queda claro, repita el procedimiento usando una solución TCEP fresco o, posiblemente, a temperatura ambiente. </li><li> Después de una hora se diluye la solución de ADN de la sonda reduce con 1 ml de solución tampón, lo que va a diluir a una concentración de 200 millas náuticas. Posteriormente, se incuba una serie de electrodos de disco de oro en porciones de 200 l de esta solución diluida de la sonda. </li><li> Recién preparar por lo menos 2 ml de 2 mm mercaptohexanol en tampón fosfato salino. </li></ol> 2. Sensor de preparación <ol><li> Combine 0,05 micras de polvo de aluminio con agua en un paño fino. Polaco una serie de electrodos de disco de oro (CH Instruments, Austin, TX) presionando la superficie de oro con firmeza en la tela húmeda, y moviéndolos en forma de ocho patrones durante aproximadamente tres minutos por cada electrodo. </li><li> Enjuague los electrodos pulido con DI-agua y sumerja en tubos Eppendorf rellenas con los mismos. Sonicar durante cinco minutos para eliminar cualquier polvo de alúmina residual. </li><li> Colocar los electrodos en una solución 0,5 M de ácido sulfúrico, la fijación a un potenciostato, junto con un contador de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia, y ejecutar una serie de voltamogramas para oxidar, reducir y electroquímicamente limpien sus superficies. Después de esto realizar una segunda limpieza electroquímico en una solución de 0,01 M de KCl en 0,1 M de ácido sulfúrico. Los detalles de estos procedimientos de limpieza se pueden encontrar en nuestra naturaleza el papel Protocolos n º 1, y en el suplemento de este video. </li><li> Organizar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf en un rack y rellene cada uno con 200 l de la solución de ADN de la sonda. La concentración de la sonda de ADN en esta solución se define la densidad con la que la sonda de ADN de paquete en la superficie del sensor. El rendimiento del sensor es fuertemente dependiente de la densidad de la sonda, con la densidad óptima que van desde la arquitectura del sensor a la siguiente. La concentración de sonda utilizada en este paso lo que debe ser optimizado para cada nuevo tipo de sensor 2. Para las arquitecturas de la sonda se ha investigado hasta la fecha, las concentraciones de ADN de la sonda que empleamos en este rango de paso de 15 nm a 2 micras, con 200 nM de ser un valor típico. </li><li> Enjuague los electrodos de disco de oro con DI-agua, y luego sumergirlas en la solución de sondas de ADN correspondientes en un tubo Eppendorf durante una hora. En este punto, la sonda de ADN se unen a la superficie del electrodo de oro a través de la formación de una monocapa de auto-tiol en oro montado. </li><li> Enjuague los electrodos con agua DI-, lavarlos en 2 mM mercaptohexanol en un tubo Eppendorf y guárdelas en un lugar oscuro durante 3 horas a la noche a temperatura ambiente para asegurar la formación completa de la monocapa de auto-ensambladas. Este paso incluye la mercaptohexanol como parte de una monocapa mixta para garantizar la formación de una monocapa estable. Para evitar la evaporación es posible que desee para sellar el electrodo en el tubo Eppendorf con parafilm. Los sensores pueden ser almacenados en esta solución durante varios días si es necesario. </li><li> Cuando esté listo para usar el sensor, se enjuaga con agua DI-y luego en remojo en una solución tampón por lo menos durante diez minutos. Sensores destinados a la detección de anticuerpos también debe ser sumergido en una solución de 100 nm de la cadena el reconocimiento correspondiente antes de su uso, seguido de un extremadamente rápido enjuague con tampón. </li></ol> 3. Prueba de sensor, detección de ADN <ol><li> En este protocolo, una cadena de 17 nucleótidos de la sonda es colocada en un electrodo de oro. Cuenta con un reportero de azul de metileno redox en su extremo 3 '(figura 1). Cuando la molécula sonda se hibrida con una cadena de captura, la corriente a través del circuito del sensor disminuye. </li><li> Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en un espacio en blancomuestra que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Coloque un electrodo contador de platino y un electrodo de plata / cloruro de plata en la solución de referencia. </li><li> Ejecutar una medida de la onda cuadrada 0 a -0,6 V con una amplitud de 25 mV y un tamaño de paso de 1 mV. La frecuencia óptima de onda cuadrada dependerá de los detalles de la arquitectura de la sonda 2,3, para las arquitecturas de la sonda que han empleado los valores óptimos están típicamente en el rango de 60 a 600 Hz. Usted debe ver un pico redondeado en aproximadamente -0,35 V, el potencial redox de azul de metileno (el máximo potencial puede variar ligeramente en función del pH exacto de su solución de prueba). La altura desde la base de referencia actual para este pico es proporcional a la eficiencia de la transferencia de electrones entre el azul de metileno y el electrodo de oro (Figura 2). Guardar esta medida de fondo. </li><li> Mover los electrodos en una solución que contiene la molécula de ADN de interés objetivo, equilibrar (5 a 120 minutos dependiendo del tamaño, estructura y concentración de la target4, 5) y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar a partir de la medición del fondo inicial,. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de la sustancia analizada. Se trata de los datos de salida principal de este sensor (Figura 3). </li><li> La medición del cambio de la señal relativa, el porcentaje de disminución o aumento de la señal en relación con el pico de fondo, es a menudo más reproducible que la medición del cambio absoluto en la actual, ya que corrige las variaciones en la superficie del electrodo. Para ello, la diferencia entre la corriente de pico y el pico de corriente de fondo están divididos por el pico de fondo actual. </li></ol> 4. Sensor de la regeneración <ol><li> Una vez que sus mediciones se completa, mueva el sensor en un recipiente lleno de agua para la DI-30 s, o de chorro con un flujo constante de agua para la DI-30 s. Repita esto dos veces más con agua desionizada fresca. Nota: algunos analitos son resistentes a este enfoque, para ellos tratar de aclarar agresiva en 6 millones de clorhidrato de guanidina o etanol al 70%. </li><li> Coloque el sensor de nuevo en una solución donde las mediciones se realizarán. En un minuto, la altura del pico debería haber vuelto a su valor original. Vale la pena señalar que estos sensores a menudo muestran un cambio de señal un poco más grande en su primera prueba y el ciclo de regeneración, y los resultados muy consistentes durante los ciclos posteriores 6. </li></ol> 5. Prueba de sensor, la detección de anticuerpos <ol><li> En este protocolo, la sonda de ADN con azul de metileno y tiol modificados utilizados en estos sensores sirve como un "ancla" cadena 7. Que se conecta directamente al electrodo de oro. Esta es entonces hibridado con una segunda, cadena de "reconocimiento" de ADN que se ha conjugado covalentemente al antígeno correspondiente (Figura 4). Hemos tenido buena suerte con la síntesis de las casas comerciales, tales como las tecnologías y Biosearch Panagene, para la síntesis del ADN de antígeno necesaria quimeras. La etapa de la hibridación se lleva a cabo mediante la transferencia de un sensor de pre-fabricados en un tubo Eppendorf que contiene 100 nM de la cadena de reconocimiento del ADN correspondiente en PBS durante 1 hora. </li><li> Coloque el sensor en la solución en blanco correspondiente. Adjuntar a la cabeza del electrodo de trabajo de un potenciostato y un lugar contraelectrodo de platino y la plata / electrodo de plata cloruro de referencia en la solución. </li><li> Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia de onda cuadrada óptima es de 60 Hz. Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo. </li><li> La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, incubar por 5 a 60 minutos, y recoger una voltammagram segunda onda cuadrada. Si el anticuerpo está presente meta el pico a -0.35 V se reducirá. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración de anticuerpos. </li></ol> 6. Prueba de sensor, la detección de moléculas pequeñas <ol><li> En este caso, la molécula de la sonda sobre la superficie del sensor es un aptámero, una molécula de ADN o ARN que ha sido seleccionado in vitro para enlazar un analito específico molecular, que los cambios en su estructura (pliegues) en unión a su analito 8,9 ( Figura 5). Aquí contamos con un enlace de cocaína, aptámero de ADN desarrollada por el laboratorio de 10,11 Stojanovic. </li><li> Enjuague un sensor nuevo con DI-agua y sumerja en una muestra en blanco que carecen de la meta a fin de registrar la señal de fondo que produce. Conecte el sensor al cable del electrodo de trabajo de un potenciostato. Colocar un contador de platino y una referencia de plata / cloruro de plata en la solución. </li><li> Realizar voltamperometría de onda cuadrada como se describió anteriormente. Para la arquitectura de la sonda en particular que hemos empleado aquí la frecuencia óptima de onda cuadrada es de 200Hz (Sin embargo, 60 Hz también funciona). Usted debe ver un pico redondeado alrededor de -0,35 V. Guardar esta medida de fondo. </li><li> La transferencia de los electrodos a una solución que contiene el analito, se incuba durante ~ 5 min, y cobrar un voltammagram segunda onda cuadrada. La altura del pico a -0.35 V va a cambiar. La magnitud de este cambio está relacionado con la concentración del analito. Si usted no puede obtener una muestra de la cocaína, procaína, cuyo uso no está regulada, puede ser utilizado como un sustituto. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Cuando se utiliza para detectar el ADN utilizando la arquitectura en primer lugar, la señal debe disminuir al menos un 60% cuando se equilibra a meta 200 nm. Después de tres lavados brevemente en agua destilada, la señal debe volver muy cerca (a menos de 0,1-5%) a su valor original. Sensores de detección de anticuerpos deben ser sometidos a una disminución de la señal de 40 a 80%. Aptámero basada en sensores para la detección de cocaína muestran un aumento de la señal de hasta un 200% dependiendo de la cobertura de la frecuencia y la superficie a la que trabajan. Para el sensor de cocaína, una baja cobertura de la superficie es el mejor 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Detección de ADN con un biosensor de ADN electroquímico. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Captura de pantalla que muestra la señal producida por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Captura de pantalla que muestra las señales producidas por un biosensor E-ADN durante la voltamperometría de onda cuadrada, antes y después de la hibridación con un analito. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Detección de anticuerpos con un biosensor de andamios. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Detección de la cocaína o la procaína con un biosensor electroquímico aptamer. <table border="1"><tbody><tr><td> Costumbre Oligo </td><td> Secuencia </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sonda lineal de ADN (LP17) </td><td> 5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 ' </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr><tr><td> ADN diana analito </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Sin modificar </td></tr><tr><td> Reconocimiento Strand </td><td> 5'-antígeno-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 ' </td><td></td></tr><tr><td> Andamio de anclaje </td><td> 5'-HS-(CH2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr><tr><td> A4 cocaína aptámero </td><td> 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 ' </td><td> HPLC purificada, se puede pedir con SS </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Sonda y secuencias de ADN diana.

<ol><li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+electrode-immobilized%2C+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li>
<li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Probe+Length%2C+Probe+Geometry%2C+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li>
<li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-Based+Electrochemical+Biosensors%3A+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li>
<li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Specific%2C+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood%2C+Soil%2C+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless%2C+Reusable+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li>
<li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein%3FSmall+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li>
<li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electronic%2C+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid%2C+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li>
<li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Prada, P. de, Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li>
<li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Reusable%2C+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li>
<li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Specificity%2C+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li>
<li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li>
<li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless%2C+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li>
<li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li>
<li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%2C+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic%2C+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li>
</ol>

Una nota importante es que ninguno de los experimentos descritos anteriormente funcionará correctamente a menos que los electrodos se han limpiado adecuadamente. Aquí está una guía a nuestro procedimiento de limpieza electroquímica. Cuando se trabaja con CH potenciostatos Instruments, que ejecutar estos pasos de limpieza con un conjunto de tres programas de macro. Fase Cero (E-limpia O) Sumergir los electrodos en 0.5MH 2 SO 4 y su conexión a los electrodos de trabajo de un potenciostato. También adjunte y sumergirse en una referencia Ag / AgCl y electrodo auxiliar de platino. Comienza con una etapa de oxidación (2 V por 5 s) y luego una etapa de reducción (0,35 V durante 10 s). Phase One (E-limpia 1) Iniciar la oxidación y la reducción de las exploraciones en las mismas condiciones ácidas (0.5MH 2 SO 4) 0,35 a 1,5 V (20 escanea a una velocidad de barrido de 4 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V, seguido de cuatro escanea a una velocidad de barrido de 0,1 V / s, y un intervalo de muestreo de 0,01 V). La segunda fase (E-limpia 2) Llevar a cabo otra serie de oxidación electroquímica y la reducción de las exploraciones en condiciones de acidez (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4), que abarca cuatro gamas diferentes potenciales (todos ellos realizados por 10 segmentos en una velocidad de barrido de 0,1 V s 1 y un intervalo de muestreo de 0,01 V ): (i) alcance potencial de 0,2 a 0,75 V, (ii) el rango potencial 0,2 a 1,0 V, (iii) potencial de rango 0,2 a 1,25 V, (iv) alcance potencial de 0,2 a 1,5 V. Muchos tipos de electrodos de oro se pueden utilizar para llevar a cabo estos experimentos. Además de los electrodos de disco de oro, como los que trabajan aquí, hemos tenido éxito con las superficies de oro microfabricated, hilo de oro, y oro en los tableros de circuitos impresos. Junto con los sensores descritos en este documento, muchas otras arquitecturas biosensor electroquímico de ADN han sido reportados. Esto incluye los sensores con una pseudoknot 12, capítulo 13 triples, 14 bocadillo, sandwich Super 15, o la arquitectura de triple 16. En el futuro, esperamos que estos sensores se utilizan en el punto de atención de diagnóstico médico. Se han integrado con éxito en varios dispositivos de microfluídica 17,18, y ofrecen muchas ventajas sobre los sistemas ópticos de detección de analitos. En particular, estos sensores pueden funcionar en turbio, ópticamente denso y altamente muestras auto-fluorescentes.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Los electrodos de oro en disco </td><td> CH Instrumentos </td><td> CHI101 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Sonda de ADN sintético </td><td> Biosearch Tecnologías </td><td> Costumbre </td><td></td></tr><tr><td> ADN sintético blanco </td><td> Sigma Genosys </td><td> Costumbre </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> Almacenar en lugar fresco y oscuro </td></tr><tr><td> Electrodo de platino </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Ag / AgCl de referencia </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Pueden ser reutilizados </td></tr><tr><td> Paño de limpieza </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Alúmina polaco </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato buffer salino, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instrumentos 605A </td><td> CH Instrumentos </td><td> 605A </td><td> Utilice cualquier potenciostato </td></tr><tr><td> Suero de ternera recién nacido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Almacenan congelados </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Utilice cualquier UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Almacenan congelados </td></tr><tr><td> Cocaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA requiere licencia </td></tr><tr><td> Procaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Sustituto de la cocaína </td></tr><tr><td> Anticuerpo anti-Flag </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de adn electroquímico biosensores para la detección reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Como se practica actualmente la medicina, los médicos enviar las muestras a un laboratorio central de pruebas y por lo tanto hay que esperar horas o días para recibir los resultados. Muchos de los pacientes estarían mejor atendidos por las pruebas rápidas de cabecera. Para ello nuestro laboratorio y otros han desarrollado una plataforma versátil, reagentless biosensor que apoya la cuantitativa, la detección reagentless, electroquímica de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), las proteínas (anticuerpos) y analitos pequeñas moléculas sin procesar directamente en muestras clínicas y ambientales. En este video, se demuestra la preparación y utilización de biosensores varios en este &quot;E-DNA&quot; de clase. En particular, fabricamos y demostrar sensores para la detección de una secuencia de ADN diana en una mezcla de reacción de polimerasa en cadena, un anticuerpo específicos para el VIH y la cocaína las drogas. El procedimiento de preparación sólo requiere de tres horas de práctica en el esfuerzo seguido de una incubación durante la noche, y su uso requiere sólo unos minutos.

&quot;ADN electrónico&quot; sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

Tal como se practica la medicina actualmente, los médicos envían las muestras a un laboratorio central para su análisis y, por lo tanto, deben esperar horas o días para recibir los resultados. ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar y utilizar sensores electroquímicos de ADN. Esto se logra primero reduciendo el ADN sonda y luego limpiando los electrodos de oro sobre los cuales se construyen los sensores. El siguiente paso del procedimiento consiste en depositar una monocapa autoensamblada de tiol sobre oro que contenga la sonda de ADN sobre los electrodos de oro.Luego, la superficie del electrodo de oro se satura con mercaptoetanol. Con el fin de garantizar la formación de una monocapa completa y bien organizada, el paso final del procedimiento consiste en emplear los sensores y muestras como tampón, orina, suero o sangre. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren las concentraciones del analito mediante cambios en la corriente pico de voltametría de onda cuadrada o de corriente alterna.Esta técnica tiene amplias implicaciones en diagnósticos moleculares porque estos sensores pueden detectar muchos biomarcadores y moléculas de fármacos diferentes directamente en orina o suero. El Sr. Aaron Rowe, un estudiante de posgrado de mi grupo de investigación, demostrará el procedimiento. Contará con la asistencia de dos investigadores postdoctorales que trabajan con nosotros, el Dr. Ryan White y el Dr. Andrew Bonham.Para comenzar, adquiera la sonda específica y el ADN de una empresa de síntesis personalizada de oligonucleótidos; durante la síntesis, la sonda se modifica mediante la adición de un tiol de seis carbonos en su extremo cinco prime y un azul de metileno redox-activo en su extremo tres prime. Disuelva el ADN de la sonda para obtener una solución con un tinte azul visible proveniente del grupo azul de metileno. Verifique su concentración midiendo su absorbancia a 260 nanómetros, utilizando un espectrofotómetro. Para reducir cualquier enlace disulfuro que pudiera estar presente en la solución de ADN de la sonda, combine un microlitro de la solución stock de ADN de la sonda con dos microlitros de solución TEP recién preparada.Mezcle suavemente la solución resultante con una pipeta. Incube la mezcla durante una hora en un recipiente oscuro y refrigerado. Durante la incubación, la solución azul debe volverse transparente a medida que el TEP reduce reversiblemente el azul de metileno.A continuación, diluya la solución del sonda de ADN reducida con tampón PBS hasta la concentración deseada, que generalmente se encuentra entre 25 y 1000. La preparación del sensor anómolar comienza combinando polvo de Illumina de 0,05 micrones con agua sobre un paño de pulido fino. Utilice este paño para pulir un conjunto de electrodos de disco de oro presionando firmemente la superficie de oro contra el paño húmedo y moviéndolos en un patrón de ocho durante aproximadamente tres minutos por electrodo.Lave los electrodos pulidos con agua desionizada tras el enjuague. Súmérjalos en tubos EOR llenos con agua desionizada. A continuación, someta los electrodos a sonicación durante cinco minutos para eliminar cualquier residuo de polvo Illumina.Después de la sonicación, coloque los electrodos en una solución de ácido sulfúrico 0,5 molar. Luego coloque un electrodo de platino como electrodo contrarreferencia y un electrodo de plata/cloruro de plata como electrodo de referencia en la solución y conéctelos a un potenciostato. A continuación, realice una serie de voltamogramas para limpiar electroquímicamente las superficies de los electrodos.Los detalles de estos procedimientos se incluyen en el suplemento escrito de este video y en un artículo de Nature Protocols publicado previamente por este grupo. A continuación, realice una segunda limpieza electroquímica en una solución de KCl en ácido sulfúrico según el procedimiento descrito anteriormente. Luego, organice un conjunto de tubos Eppendorf de dos mililitros en un soporte y llene cada uno con 200 microlitros de la solución de ADN sonda.La concentración de la sonda, ADN en esta solución, definirá la densidad con la que el ADN de la sonda se empaqueta en la superficie del sensor y debe optimizarse para cada nuevo tipo de sensor. Enjuague los electrodos de disco de oro con agua desionizada. Luego, sumérjalos en la solución correspondiente de la sonda de ADN en un tubo einor durante una hora.En este punto, el ADN sonda se unirá a la superficie del electrodo de oro mediante la formación de una monocapa autoensamblada de tiol sobre oro. Después de enjuagar nuevamente los electrodos con agua desionizada, sumérjalos en etanotiol 2 mM en un tubo einor. Este paso rellena la superficie, garantizando una monocapa autoensamblada completa y estable.Para evitar la evaporación, selle los electrodos dentro del tubo einor con paraformo. Almacene los electrodos sumergidos en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante tres horas hasta toda la noche para asegurar la formación completa de la monocapa autoensamblada. Para preparar el sensor para su uso después de la incubación, enjuáguelo con agua desionizada y luego sumérjalo en tampón durante al menos 10 minutos.Se demuestra la detección de ADN con sensores utilizando una sonda de 17 nucleótidos unida a un electrodo de oro mediante un grupo tiol en su extremo cinco prima; la sonda contiene un marcador redox de azul de metileno en su extremo tres prima. Cuando la molécula de sonda se hibrida con una cadena de captura, la corriente electroquímica producida por el sensor disminuye. Para comenzar, enjuague un sensor nuevo con agua desionizada y sumérjalo en una muestra en blanco.Para registrar la señal de fondo, realice una medición con onda cuadrada desde cero hasta -0,6 voltios con una amplitud de 25 milivoltios y un voltaje de paso de un milivoltio. La frecuencia óptima de la onda cuadrada dependerá de los detalles de la arquitectura de la sonda. Debe aparecer un pico redondeado aproximadamente a -0,25 voltios, que corresponde al potencial redox del azul de metileno.La altura de la corriente de línea base hasta este pico es proporcional a la eficiencia de la transferencia de electrones entre el azul de metileno y el electrodo de oro. Guarde esta medición de fondo. A continuación, traslade los electrodos a una solución que contenga la molécula de ADN diana de interés y permita que se equilibren.Alternativamente, se puede añadir ADN diana a la solución en la que están sumergidos los sensores. Registre un segundo voltamograma de onda cuadrada. La altura del pico a -0,25 voltios cambiará con respecto a la medición inicial del fondo.La magnitud de este cambio está relacionada con la concentración del analito. Es el dato principal de salida del sensor. Tras la medición, calcule el cambio relativo de la señal.Este porcentaje suele ser más reproducible que medir el cambio absoluto en la corriente, ya que corrige las variaciones entre electrodos en el área de superficie. Una vez completado el procedimiento, el sensor puede regenerarse según se describe en el procedimiento escrito adjunto para la detección de anticuerpos. Al utilizar los sensores, el ADN modificado con azul de metileno y tiol actúa como cadena ancla y se une directamente al electrodo de oro.A continuación, se hibrida con una segunda cadena de ADN de reconocimiento que ha sido conjugada covalentemente al antígeno correspondiente. Luego se realiza una incubación con un anticuerpo específico dirigido al blanco. Realice el paso de hibridización transfiriendo un sensor prefabricado a un tubo einor que contiene 100 nano molar de la secuencia de reconocimiento correspondiente.Incube el sensor durante una hora con la hebra de ADN en PBS. A continuación, sumérjalo en tampón PBS para eliminar cualquier sonda no hibridada antes de transferirlo a la solución en blanco. Después, coloque el sensor en la solución en blanco correspondiente y coloque un electrodo de platino como electrodo auxiliar y un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata en la solución.Conecte los electrodos al potenciostato. Realice la voltametría de onda cuadrada tal como se describió anteriormente; la frecuencia óptima de la onda cuadrada para la arquitectura específica de la sonda utilizada en este ejemplo es de 60 hercios. Debe aparecer un pico redondeado alrededor de -0,25 voltios.Guarde esta medición de fondo. Transfiera los electrodos a una solución que contenga el analito objetivo tras una incubación de cinco a 60 minutos, y registre un segundo voltamograma de onda cuadrada. Si el anticuerpo objetivo está presente, el pico a -0,25 voltios disminuirá.La magnitud de este cambio está relacionada con la concentración de anticuerpos. Para demostrar la detección de moléculas pequeñas, el ADN sonda en la superficie del sensor es un aptámero. Un aptámero es una molécula de ADN o ARN que ha sido seleccionada in vitro para unirse a un analito molecular específico.Los aptámeros a menudo se pueden volver a diseñar para cambiar su estructura. Tras dicha unión, el aptima empleado aquí cambia su conformación al unirse a la droga cocaína.Para comenzar, enjuague un sensor nuevo con agua desionizada y sumérjalo en una muestra en blanco, que carezca del analito, con el fin de registrar la señal de fondo que produce. Luego, coloque un contraelectrodo de platino y un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata en la solución. Conecte los electrodos a los cables de un potenciostato y realice una voltametría de onda cuadrada o de corriente alterna.Como se describió anteriormente, la frecuencia de onda cuadrada óptima para la arquitectura específica de la sonda utilizada aquí es de 60 hercios. Nuevamente, debe aparecer un pico redondeado alrededor de -0,25 voltios y debe guardarse como la medición de fondo. A continuación, transfiera los electrodos a una solución que contenga el analito objetivo.Después de una 32.ª incubación, recolecte un segundo voltamograma de onda cuadrada o de corriente alterna. La altura del pico a -0,25 voltios cambiará. La magnitud de este cambio está relacionada con la concentración del analito diana.Cuando se utilizan biosensores electroquímicos de ADN para detectar ADN con la arquitectura de sonda descrita aquí, la señal debe disminuir al menos un 60%. Tras el equilibrio con un blanco de 200 nanomolares después de tres enjuagues breves con agua desionizada, la señal debe recuperar un valor comprendido entre el 0,1 y el 5 % de su valor original. De manera similar, cuando los sensores descritos aquí se utilizan para detectar anticuerpos, la señal debe disminuir entre un 40 % y un 80 % tras la unión del anticuerpo. Por el contrario, los sensores basados en aptámeros para la detección de cocaína presentan un aumento de la señal de hasta un 200 % tras la unión de moléculas pequeñas.La magnitud de este cambio depende de la frecuencia de interrogación electroquímica y de la cobertura superficial en los sensores. Para el sensor de cocaína, una cobertura superficial relativamente baja es la más adecuada. Una vez dominada, la fabricación y el uso de estos sensores puede realizarse en un solo día.Es importante recordar al realizar este procedimiento que parámetros como la frecuencia de onda cuadrada o la densidad de sondas en la superficie del electrodo afectan considerablemente el rendimiento del sensor. Después de ver este video, sabrá cómo preparar biosensores electroquímicos, biosensores de ADN, biosensores de aptámeros y biosensores con andamiaje, y conocerá cómo utilizarlos para una amplia variedad de mediciones básicas. Los únicos riesgos significativos en este protocolo son el uso de ácido sulfúrico, que obviamente es cáustico, por lo que el uso de protección ocular y guantes es obligatorio.

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