Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

"ADN electrónico" sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

El objetivo general de este procedimiento es preparar y emplear sensores electroquímicos de ADN. Esto se logra reduciendo primero el ADN de la sonda y luego limpiando los electrodos de oro sobre los que se construyen los sensores. El siguiente paso del procedimiento es depositar un tiol en una monocapa autoensamblada de oro que contiene la sonda, el ADN, en los electrodos de oro.

A continuación, la superficie del electrodo de oro se rellena con mercaptoetanol. Para garantizar la creación de una monocapa completa y bien formada, el paso final del procedimiento es emplear los sensores y muestras como tampón, orina, suero o sangre. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran las concentraciones de analito a través de cambios en la corriente máxima de voltios de onda cuadrada o corriente alterna.

Esta técnica tiene implicaciones de gran alcance en el diagnóstico molecular, ya que estos sensores pueden detectar muchos biomarcadores y moléculas de fármacos diferentes directamente en la orina o el suero. El Sr. Aaron Rowe, estudiante de posgrado en mi grupo de investigación, hará una demostración del procedimiento. Contará con la asistencia de dos becarios postdoctorales que trabajan con nosotros, el Dr. Ryan White y el Dr. Andrew Bonham.

Para comenzar a comprar la sonda relevante, el ADN de una empresa de síntesis de oligonucleótidos personalizada, la sonda se modifica durante la síntesis mediante la adición de un tiol de seis carbonos en su extremo de cinco primos y un azul de metileno activo redox en su extremo de tres primos que disuelve el ADN de la sonda para producir una solución con un tinte azul visible que surge de la fracción de azul de metileno. Verifique su concentración midiendo su absorbancia a 260 nanómetros, utilizando un espectrofotómetro para reducir cualquier enlace disulfuro que pueda estar presente en la solución de ADN de la sonda. Combine un microlitro de la solución madre de ADN de la sonda con dos microlitros de solución TEP recién preparada.

Mezcle suavemente la solución resultante con una pipeta. Incuba la mezcla durante una hora en un recipiente refrigerado oscuro. Durante la incubación, la solución azul debe aclararse ya que el TEP reduce reversiblemente el azul de metileno.

A continuación, diluya la solución de sonda de ADN reducida con tampón PBS hasta la concentración deseada, que suele estar entre 25 y 1000. La preparación del sensor molar Ano comienza con la combinación de polvo de Illumina de 0,05 micras con agua en un paño de pulido fino. Use este paño para pulir un juego de electrodos de disco de oro presionando la superficie de oro firmemente en el paño húmedo y moviéndolos en un patrón en forma de ocho durante aproximadamente tres minutos por electrodo.

Enjuague los electrodos pulidos con agua desionizada después del enjuague. Sumérgelos en tubos EOR llenos de agua desionizada. A continuación, sonique los electrodos durante cinco minutos para eliminar cualquier polvo residual de Illumina.

Después de la sonicación, coloque los electrodos en una solución de ácido sulfúrico 0,5 molar. A continuación, coloque un contraelectrodo de platino y un electrodo de referencia de plata, cloruro de plata en la solución y conéctelos a un estado de potencial. A continuación, ejecute una serie de vol gramas para limpiar electroquímicamente las superficies de los electrodos.

Los detalles de estos procedimientos se incluyen en el suplemento escrito de este video y en un documento de protocolos de Nature publicado previamente por este grupo. Después de esto, realice una segunda limpieza electroquímica en una solución de KCL en ácido sulfúrico de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. A continuación, coloque un juego de dos tubos de einor de mililitros en Irak y llene cada uno con 200 microlitros de la solución de ADN de la sonda.

La concentración de ADN de la sonda en esta solución definirá la densidad con la que se empaqueta el ADN de la sonda en la superficie del sensor y debe optimizarse para cada nuevo tipo de sensor. Enjuague los electrodos de disco de oro con agua desionizada. A continuación, sumérjalos en la sonda correspondiente, la solución de ADN en un tubo de einor durante una hora.

En este punto, el ADN de la sonda se unirá a la superficie del electrodo de oro a través de la formación de una monocapa autoensamblada de tiol sobre oro. Después de enjuagar los electrodos nuevamente con agua desionizada, sumérjalos en dos milimolares de mercaptoetanol en un tubo einor. Esto rellena la superficie asegurando una monocapa autoensamblada completa y estable.

Para evitar la evaporación, selle los electrodos en el tubo de einor con paraform. Guarde los electrodos sumergidos en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante tres horas o toda la noche para garantizar la formación completa de la monocapa autoensamblada. Para preparar el sensor para su uso después de la incubación, enjuague el sensor con agua desionizada y luego sumérjalo en tampón durante al menos 10 minutos.

La detección de ADN con sensores se demuestra utilizando una hebra de sonda de 17 nucleótidos unida a un electrodo de oro a través de un tiol en sus cinco extremos principales, la sonda contiene un reportero redox de azul de metileno en sus tres extremos principales. Cuando la molécula de la sonda se hibrida con una hebra de captura, la corriente electroquímica producida por el sensor disminuye. Para comenzar, enjuague un sensor nuevo con agua desionizada y sumérjalo en una muestra en blanco.

Para registrar la señal de fondo, produce una medición de onda cuadrada de cero a menos 0,6 voltios con una amplitud de 25 milivoltios y un voltaje escalonado de un milivoltio. La frecuencia óptima de onda cuadrada dependerá de los detalles de la arquitectura de la sonda. Un pico redondeado debe aparecer aproximadamente a 0,25 voltios negativos, el potencial redox del azul de metileno.

La altura de la corriente de referencia a este pico es proporcional a la eficiencia de la transferencia de electrones entre el azul de metileno y el electrodo de oro. Guarde esta medición de fondo. A continuación, mueva los electrodos a una solución que contenga la molécula de ADN objetivo de interés y permita que se equilibren.

Alternativamente, se puede agregar ADN objetivo a la solución en la que se sumergen los sensores. Recoge un segundo voltio de onda cuadrada Graham. La altura del pico a menos 0,25 voltios cambiará con respecto a la medición inicial de fondo.

La magnitud de este cambio está relacionada con la concentración del analito. Son los principales datos de salida del sensor. Después de la medición, calcule el cambio relativo de la señal.

Este porcentaje suele ser más reproducible que medir el cambio absoluto de corriente, ya que corrige las variaciones de electrodo a electrodo en el área de superficie. Una vez finalizado el procedimiento, el sensor puede regenerarse como se describe en el procedimiento escrito adjunto para la detección de anticuerpos. Usando los sensores, el azul de metileno y el ADN modificado con tiol sirve como hebra de anclaje y se une directamente al electrodo de oro.

A continuación, se hibrida con una segunda cadena de reconocimiento, la de ADN, que se ha conjugado covalentemente con el antígeno correspondiente. A esto le sigue la adición de una incubación con un objetivo de anticuerpo específico. Llevar a cabo la etapa de hibridación transfiriendo un sensor prefabricado a un tubo de einor que contenga 100 nano molares del reconocimiento correspondiente.

La hebra de ADN en PBS incuba el sensor durante una hora. Siga esto con inmersión en tampón PBS para eliminar cualquier sonda no hibridada antes de pasar a la solución en blanco. A continuación, coloque el sensor en la solución en blanco correspondiente y coloque un contador de platino y un electrodo de referencia de plata, cloruro de plata en la solución.

Realice la telemetría de volumen de onda cuadrada como se describió anteriormente, la frecuencia de onda cuadrada óptima para la arquitectura de sonda particular utilizada en este ejemplo es de 60 hercios. Debería aparecer un pico redondeado alrededor de 0,25 voltios negativos.

Guarde esta medición de fondo. Transfiera los electrodos a una solución que contenga el analito objetivo después de una incubación de cinco a 60 minutos, recoja una segunda volta de onda cuadrada. Si el anticuerpo objetivo está presente, el pico a menos 0,25 voltios disminuirá.

La magnitud de este cambio está relacionada con la concentración de anticuerpos. Para demostrar la detección de moléculas pequeñas, el ADN de la sonda en la superficie del sensor es un aptr. Un aptr es una molécula de ADN o ARN que ha sido seleccionada in vitro para unirse a un analito molecular específico.

Los aptámeros a menudo se pueden rediseñar para cambiar su estructura. Sobre dicha obligación. La áptera empleada aquí cambia su confirmación al unirse a la droga cocaína.

Para empezar, enjuague un sensor nuevo con agua desionizada y sumérjalo en una muestra en blanco, sin el objetivo para registrar la señal de fondo que produce. A continuación, coloque un contador de platino y una referencia de plata, cloruro de plata en la solución. Conecte los electrodos a los cables de un estado de potenciales, realice telemetría de onda cuadrada o de bóveda de corriente alterna.

Como se describió anteriormente, la frecuencia de onda cuadrada óptima para la arquitectura de sonda particular utilizada aquí es de 60 hercios. Nuevamente, debe aparecer un pico redondeado alrededor de menos 0,25 voltios y debe guardarse como medición de fondo. A continuación, transfiera los electrodos a una solución que contenga el analito objetivo.

Después de una incubación número 32, recoja una segunda onda cuadrada o un voltio Graham de corriente alterna. La altura del pico a menos 0,25 voltios cambiará. La magnitud de este cambio está relacionada con la concentración del analito objetivo.

Cuando se utilizan biosensores electroquímicos de ADN para detectar ADN con la arquitectura de sonda descrita aquí, la señal debe disminuir en al menos un 60%Cuando se equilibra con un objetivo de 200 nanomolares después de tres breves enjuagues en agua desionizada, la señal debe volver a estar dentro de 0,1 a 5% de su valor original. Del mismo modo, cuando se utilizan los sensores descritos aquí para detectar anticuerpos, la señal debe disminuir entre un 40 y un 80% tras la unión del anticuerpo. Por el contrario, los sensores basados en aptima para la detección de cocaína muestran un aumento de la señal de hasta el 200% tras la unión de moléculas pequeñas.

La magnitud de este cambio depende de la frecuencia de interrogación electroquímica y de la cobertura de la superficie de los sensores. Para el sensor de cocaína. Una vez dominados, la fabricación y el uso de estos sensores se pueden realizar en un solo día.

Es importante recordar al realizar este procedimiento que parámetros como la frecuencia cuadrada o la densidad de la sonda en la superficie del electrodo afectan en gran medida el rendimiento del sensor. Después de ver este video, sabrá cómo preparar electroquímicos, biosensores de ADN, biosensores de aptámeros y biosensores de andamios, y sabrá cómo usarlos para una amplia variedad de mediciones básicas. Los únicos peligros significativos en este protocolo son el uso de ácido sulfúrico, que obviamente es una protección ocular cáustica y los guantes son obligatorios.