Name: Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende el ensayo de silenciamiento génico inducido por virus mediado por Agrobacterium en algodón. Este método utiliza vectores derivados del virus del moteado del tabaco para inducir silenciamiento de RNA y estudiar la función del gen GrCLA1.

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Estamos muy agradecidos a los Dres. SP Dinesh-Kumar y Liu Yule para TRV-VIGS vectores, y los Dres. Chuck Kenerley, Wheeler Terry, Starr y Jim Bayer CropScience para el suministro de semillas de algodón. Este trabajo fue financiado por la NSF para LS y los NIH para PH

1. Crecer las plántulas de algodón <ol><li> Sembrar las semillas del algodón (Gossypium hirsutum) variedad FiberMax 832, Phytogen 425RF, 480WR Phytogen y Deltapine 90 en macetas (7 cm de diámetro) que contienen la mezcla Metro 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li> Mantenga los recipientes en una bandeja cubierta con una cúpula de plástico a 23 ° C, 120 μE m -2 S -1 luz, con un fotoperíodo de 12 horas light/12 horas oscuras en una sala de crecimiento. </li><li> Retire la terminal cuando dos cotiledones han surgido. </li><li> Aproximadamente dos semanas después, el uso de las plantas con dos cotiledones completamente abiertos para el ensayo de VIGS. En esta etapa, las hojas verdaderas, no han salido a la luz (Figura 1). </li></ol> 2. Construir VIGS vector portador del gen GrCLA1 <ol><li> Amplificar el gen de una Alterados Cloroplastos de algodón (GrCLA1) por PCR con cebadores GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'y GrCLA1 ​​R-, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' de una biblioteca de cDNA de G. raimondii hoja de tejidos. </li><li> Digerir los productos PCR de GrCLA1 ​​con EcoRI y KpnI y se insertan en pYL156 (pTRV-ARN2) vector de la ligadura. </li><li> Pantalla de los clones en placas de agar LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina. Verificar las construcciones por la digestión con enzimas de restricción y secuenciación. </li><li> Transformar el plásmido en Agrobacterium tumefaciens GV3101 mediante electroporación y se recuperan en medio LB líquido a 28 ° C. Seleccionar los transformantes en placas con LB + kanamicina (50 mg / ml) + gentamicina (25 mg / mL). Las bacterias se pueden almacenar en un 25% de glicerol a -80 ° C para el uso a largo plazo. </li></ol> 3. VIGS realizar la inoculación <ol><li> Tres días antes de la inoculación, las acciones de glicerol racha de congelado de Agrobacterium tumefaciens llevar pYL192 (TRV): ARN1, pYL156 (TRV): ARN2 (vector por sí solo) y pYL156 (TRV): ARN2-GrCLA1 ​​en placas de agar LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina y 25 mg / ml de gentamicina. Las placas se incuban a 28 ° C durante 24 horas. </li><li> Dos días antes de la infiltración VIGS, elegir una sola colonia para construir cada uno de los platos por encima y por inocular en 5 ml de medio LB suplementado con 50 mg / ml de kanamicina y 25 mg / ml de gentamicina; Mantener el cultivo de bacterias a 28 ° C para pasar la noche en un tambor a una velocidad de 50 rpm. </li><li> La transferencia de la cultura por encima de un frasco con 50 ml de medio LB suplementado con 50 mg / ml de kanamicina y 25 mg / ml de gentamicina, además de 10 mM MES (2 - (4 morfolino)-etano sulfónico) y 20 acetosiringona M. Mantener el cultivo a 28 ° C durante la noche en una coctelera con una velocidad de 50 rpm. </li><li> Al día siguiente, vuelta a las células agro-bacteriana a 4000 rpm durante 5 minutos, volver a suspender la cultura en el buffer de la infiltración que contiene 10 mM de MgCl2, 10 mM MES y 200 acetosiringona M. Ajuste el OD 600 de la cultura a 1,5. </li><li> Salir de la cultura en el banquillo a temperatura ambiente durante 3 horas. </li><li> Antes de la infiltración Agrobacterial, ponche de la parte inferior de los cotiledones de las plantas de algodón con una aguja de 25 G sin perforar a través de los cotiledones. Uno o dos agujeros (depende de la suavidad de los tejidos) fueron perforados en cada sección de los cotiledones (Figura 2). </li><li> Mezcla de cultivo en suspensión de Agrobacterial pYL192 (TRV): ARN1 y pYL156 (TRV): ARN2 o pYL156 (TRV): ARN2-GrCLA1 ​​en una proporción de 1:1; mano infiltrarse en la mezcla de la parte inferior de los cotiledones a través de los sitios de heridas con un 1 ml jeringa sin aguja (Figura 3). </li><li> Cubrir las plantas con una cúpula de plástico y dejar que las plantas se infiltraron a temperatura ambiente bajo condiciones de luz tenue de la noche. </li><li> Transferencia de las plantas a una sala de crecimiento con la temperatura de 23 ° C, 120 μE m -2 S -1 luz con un ciclo de 12 horas horas de luz / oscuridad 12. </li></ol> Nota: VIGS funciona cuando las plantas están ya sea 23 ° C o en un invernadero (25-28 ° C). Cuando la temperatura es relativamente baja (23 a 25 ° C), es más fácil para la inoculación y el fenotipo es más uniforme en comparación con los más altos (28-30 ° C) o la temperatura fluctuó. Cubriendo las plantas con una cúpula también hace VIGS más eficiente. <ol start="10"><li> Examine el fenotipo de silenciar a las 7 ~ 8 días después de la infiltración. Las hojas de las plantas de verdad silenciada por pYL156 (TRV): ARN2-GrCLA1 ​​comenzó a mostrar el fenotipo albino (Figura 4). Las plantas se infiltraron con la realización de agrobacterias pYL156 (TRV): ARN2 servir como un control. </li><li> Verificar la eficiencia de silenciamiento de genes mediante el examen de nivel de expresión de genes endógenos usando la polimerasa de transcripción inversa reacción en cadena (RT-PCR) con ARN aislado de control y silenció las plantas de algodón. </li></ol> Nota: Las plantas VIGS de opinión deben mantenerse bajo condiciones de cuarentena contenidos y las plantas deben estar debidamente esterilizado en autoclave y desecharse después de los ensayos como TRV cuenta con una amplia gama de huéspedes y es un patógeno de declaración obligatoria. 4.Los resultados representativos: Aproximadamente dos semanas después de la mano con la mezcla de infiltración Agrobacterial, el fenotipo albino causada por GrCLA1 ​​silenciamiento se observó claramente en las hojas verdaderas. La eficiencia de silenciamiento alcanza casi el 100% en varios experimentos con más de 50 plantas. Las plantas presentan un fenotipo silenciado uniformemente distribuidos y muy fuerte albino en el desarrollo de nuevas hojas con un mosaico en las hojas mayores (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un brote de algodón alrededor de la etapa de dos semanas de edad con dos cotiledones completamente abiertos utilizados para la infiltración Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Perforación de pequeños agujeros en la parte inferior de los cotiledones de las plantas de algodón con una aguja G 25 para facilitar la infiltración Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Infiltración de la mano de la mezcla de Agrobacterial en los cotiledones de algodón a través de los sitios de heridas con una jeringa sin aguja <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Fenotipo Albino apareció en VIGS silenciado las plantas de algodón. Cuatro cultivares se muestran. A) FiberMax 832, B) Phytogen 480WR; C) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
<li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+expression+of+CLA1%2C+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li>
<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

VIGS ha demostrado ser una poderosa herramienta en el análisis de la genómica funcional de forma transitoria derribar la expresión de genes endógenos. En este estudio, hemos desarrollado un VIGS mediada por Agrobacterium mediante la utilización de un vector binario TRV-basado. El algodón CLA1 (GrCLA1) gen fue desarrollado como una marca visual para monitorear la eficiencia de silenciamiento. Siempre hemos obtenido el 100% de eficiencia de silenciamiento génico, como lo demuestra el fenotipo albino que aparecen ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre de los reactivos y equipos </th><th> Empresa </th><th> Catálogo / número de serie </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Rodillos de tambor </td><td> Glas-Col, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> Agro-bacteria cultura </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td> Sheldon Manufacturing, Inc. </td><td> 01046209 </td><td> Agro-bacteria cultura </td></tr><tr><td> UV / Vis espectrofotómetro </td><td> Beckman Coulter </td><td> Modelo: DU530 </td><td> La medición de OD </td></tr><tr><td> Gene Emisores </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652076, de serie: 154BR3880 </td><td> Electroporación </td></tr><tr><td> Generador de impulsos del controlador </td><td> BioRad </td><td> Modelo: 1652098, de serie: 232BR4833 </td><td> Electroporación </td></tr><tr><td> Micropulser cubeta de electroporación </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Electroporación </td></tr><tr><td> 1 ml jeringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> La inoculación de las agro-bacteria </td></tr><tr><td> Metro Mix 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> Plántulas de crecimiento </td></tr><tr><td> Terra Cotta olla </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> Plántulas de crecimiento </td></tr><tr><td> MES monohidrato </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> La infiltración de búfer </td></tr><tr><td> Acetosiringona </td><td> Sigma </td><td> D134406 </td><td> La infiltración de búfer </td></tr></tbody></table>

mediada por agrobacterium inducida por el virus gene ensayo silenciamiento en algodón

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Algodón (Gossypium hirsutum) es uno de los cultivos más importantes del mundo. Los esfuerzos se han hecho considerables en la reproducción molecular de nuevas variedades. El análisis genético a gran escala funcional de algodón se ha quedado atrás la mayor parte de las especies de plantas modernas, probablemente debido a su gran tamaño de la duplicación del genoma, los genes y la poliploidía, largo ciclo de crecimiento y la obstinación a la transformación genética 1. Para facilitar el estudio funcional de alto rendimiento genética / genómica en algodón, tratamos de desarrollar ensayos transitoria rápida y eficiente para evaluar las funciones de genes de algodón. Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) es una poderosa técnica que fue desarrollada con base en el host post-transcripcional silenciamiento génico (PTGS) para reprimir la proliferación viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS ha sido aplicado con éxito en una amplia gama de especies dicotiledóneas como Solanaceae, Arabidopsis y otras especies de leguminosas y especies monocotiledóneas como la cebada, el trigo y el maíz, por diversos estudios de genómica funcional 3,4. Como este método rápido y eficaz evita la transformación de plantas y supera la redundancia funcional, es particularmente atractiva y adecuada para el estudio de genómica funcional en las especies de cultivos como el algodón no es susceptible de transformación. En este estudio, se presenta el protocolo detallado de Agrobacterium VIGS sistema en el algodón. Entre los varios vectores VIGS viral, el virus del cascabel del tabaco (TRV) invade una amplia gama de huéspedes y es capaz de propagarse con fuerza a lo largo de toda la planta sin embargo, producen síntomas leves en la hosts5. Para controlar la eficacia de silenciamiento, GrCLA1, un gen homólogo de Arabidopsis Cloroplastos Alterados un gen (AtCLA1) en el algodón, ha sido clonado y se inserta en el vector binario VIGS pYL156. CLA1 gen está involucrado en el desarrollo del cloroplasto 6, y estudios previos han demostrado que pérdida de función de AtCLA1 dio lugar a un fenotipo albino de 7 hojas verdaderas, proporcionando un excelente marcador visual para silenciar la eficiencia. En aproximadamente dos semanas después de la infiltración de Agrobacterium, el fenotipo albino comenzaron a aparecer en las hojas verdaderas, con una eficiencia del 100% en silenciar a todos los experimentos replicados. El silenciamiento de la expresión de genes endógenos también fue confirmado por RT-PCR análisis. Significativamente, el silenciamiento potente podría ocurrir en todas las variedades que hemos probado, incluyendo varias variedades cultivadas comercialmente en Texas. Esta rápida y eficiente mediada por Agrobacterium VIGS ensayo proporciona una herramienta muy poderosa para un rápido análisis a gran escala de las funciones de los genes en el genoma de nivel en el algodón.

Se presenta el protocolo detallado para la mediada por Agrobacterium inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) de ensayo en el algodón. El virus del cascabel del tabaco (TRV) vectores derivados de VIGS fueron desplegados para inducir el silenciamiento de ARN de algodón GrCLA1, Alterados Cloroplastos un gen. El fenotipo albino causadas por el silenciamiento GrCLA1 ​​se observó en el estado de plántula dentro de 2 semanas después de la inoculación.

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

El algodón (Gossypium hirsutum) es uno de los cultivos más importantes a nivel mundial. Se han realizado esfuerzos considerables en el fitomejoramiento molecular de nuevas variedades. El ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un ensayo de silenciamiento génico inducido por virus mediado por agrobacterias en algodón para estudiar la función génica. Esto se logra primero cultivando plántulas de algodón hasta la etapa de 10 días a dos semanas de edad. Luego, el gen rados uno de los cloroplastos de algodón se clona en un vector de virus del mosaico de la belladona basado en vs.El tercer paso consiste en preparar cultivos de agrobacterias que contengan P-T-R-V-R-N-A uno y P-T-R-V-G-R-C-A uno. El paso final es inocular manualmente los cultivos de agrobacterias en las hojas cotiledonares del algodón. Finalmente, los resultados del silenciamiento génico pueden observarse mediante el fenotipo albino en las hojas verdaderas de las plantas de algodón aproximadamente dos semanas después.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transformación es que los VIGS proporcionan una plataforma rápida y eficiente para el estudio de la función génica en algodón. Aunque este método puede resultar una herramienta poderosa para el análisis rápido a gran escala de la función génica a nivel del genoma completo en algodón, también puede aplicarse a otras especies de cultivos importantes. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es complicado inocular manualmente los cultivos de agrobacterium y el cogollo de algodón.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética y genómica del algodón, como explorar las funciones génicas para cultivar plántulas de algodón destinadas a la silenciación génica inducida por virus. Añada Metro Mix 700 a varias macetas de siete centímetros y coloque las macetas llenas en una bandeja. A continuación, siembre las semillas de varias variedades de algodón de altura, como Fiber Max 832 Phyto, Gen 4, 25, RF Phyto, Gen Four 80 WR y Delta Pine 90.En las macetas preparadas, cubra la bandeja que contiene la maceta con una cúpula de plástico y coloque la bandeja en una cámara de crecimiento, a 23 grados Celsius, con una luz de 120 microeinsteins por metro cuadrado por segundo y un fotoperíodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Después de tres a cuatro días, una vez que hayan emergido dos hojas olean, retire la cúpula de plástico. Deje crecer las plantas de algodón durante aproximadamente 10 días, hasta que alcancen la etapa en que se hayan desarrollado dos cotiledones completamente expandidos, pero antes de que hayan emergido las hojas verdaderas. En ese momento, las plantas estarán listas para ser utilizadas en el ensayo de silenciamiento génico inducido por virus.Estos procedimientos de clonación deben realizarse durante el período de dos semanas en que las plantas de algodón alcanzan la etapa de expansión completa. Primero, amplifique un gen de los cloroplastos de algodón a partir de una biblioteca de ADNc de tejidos foliares de CACI remondi utilizando los cebadores proporcionados en el protocolo escrito, según los procedimientos estándar de PCR. Luego, digiera el producto de PCR de GCA uno con EcoR uno y KPN uno según los protocolos del fabricante de las enzimas.Visualice el producto de PCR de 500 pares de bases en un gel de bromuro de etidio. Corte la banda y extraiga el producto de PCR purificado, el cual se ligará al vector PYL 1 56. Utilizando la ligasa de ADN T4, transforme células competentes de E. coli con el vector ligado y luego extienda de 10 a 50 microlitros de las células transformadas sobre placas de agar LBA que contengan 50 microgramos por mililitro de canamicina.Incubar la placa durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Seleccionar colonias de la placa y cultivarlas durante la noche en dos mililitros de caldo LB que contenga 50 microgramos por mililitro de canamicina. Recoger las bacterias por centrifugación y realizar preparaciones de ADN según procedimientos estándar. Para purificar el ADN plasmídico, verificar los constructos mediante digestión con enzimas de restricción y secuenciación.Una vez confirmada la presencia y orientación del inserto en el vector PYL 1 56, se realiza la electrotransformación del plásmido en Agrobacterium tumefaciens GV 3 1 0 1 y se lleva a cabo el rescate en medio líquido LB a 28 grados Celsius. Seleccione los transformantes en placas de agar LBI que contengan 50 microgramos por mililitro de canamicina y 25 microgramos por mililitro de gentamicina. Si se desea, las bacterias pueden almacenarse en glicerol al 25% a menos 80 grados Celsius.Tres días antes de la inoculación, realice estrías a partir de stocks glicerolados de Agrobacterium tumefaciens que portan PYL 1 9 2 RNA uno PY, 1 56 RNA dos y PY 1 56 RNA dos GLA uno en placas de agar LB con antibiótico, e incube las placas a 28 grados Celsius durante 24 horas. Al día siguiente, seleccione una colonia individual para cada construcción e inocule cada colonia en cinco mililitros de medio LB, suplementado con 50 microgramos por mililitro de canamicina y 25 microgramos por mililitro de gentamicina.Cultive la bacteria a 28 grados Celsius durante la noche en un agitador ajustado a una velocidad de 50 rotaciones por minuto. Transfiera la cultura PYL 1 56 RNA dos GLA uno y las culturas control a matraces separados que contengan 50 mililitros de medio LB suplementado con 50 microgramos por mililitro de canamicina y 25 microgramos por mililitro de gentamicina más 10 milimolares de MES y 20 micromolares de acetosiringona. Cultive la bacteria a 28 grados Celsius durante la noche en un agitador ajustado a una velocidad de 50 rotaciones por minuto.Al día siguiente, transfiera los cultivos a tubos de centrífuga y centrifugue las células bacterianas agrobacterianas a 4.000 rotaciones por minuto durante cinco minutos; re suspenda el cultivo en el tampón de infiltración que contiene cloruro de magnesio 10 milimolar, MES 10 milimolar y acetosirina 200 micromolar. Mida la DO600 del cultivo y ajústela a 1,5 con el tampón de infiltración. Incube el cultivo en la mesa a temperatura ambiente durante tres horas antes de la infiltración foliar con bacterias agrobacterianas.Perfore la parte inferior del capullo de algodón de las plantas de algodón con una aguja de calibre 25 sin atravesar completamente el capullo. Se hacen uno o dos orificios en cada sección del capullo. A continuación, mezcle el cultivo bacteriano agrobacteriano de PYL 1 92 ARN uno con el de PYL 1 56 ARN dos o con PY 1 56 ARN dos GRCA uno en una proporción uno a uno.Luego, utilizando una jeringa o aguja de un mililitro, introduzca la mezcla en la parte inferior de las hojas de cotiledón a través de los orificios perforados. Cubra las plantas con una cúpula de plástico y deje las plantas infiltradas a temperatura ambiente y bajo condiciones de luz tenue durante la noche.Transfiera las plantas a una sala de crecimiento con una temperatura de 23 grados Celsius, luz de 120 micro Einstein por metro cuadrado por segundo y un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Examine el fenotipo de silenciamiento entre siete y ocho días posteriores a la infiltración. En este momento, las hojas verdaderas de las plantas silenciadas por PY 1 56 RNA dos GLA uno comienzan a mostrar el fenotipo albino.Las plantas infiltradas con bacterias agrobacterias que portan PYL 1 56 ARN dos sirven como control. Verifique la eficiencia del silenciamiento génico examinando el nivel de expresión de genes endógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción utilizando ARN aislado de plantas de algodón control y silenciadas según procedimientos estándar.Esta imagen muestra un cultivar Fiber Max 8 3 2 tras el silenciamiento génico inducido por virus del gen GLA uno. Observe las hojas de color blanco donde ha ocurrido el silenciamiento génico aquí. Un cultivar PHYTO cuatro 80 WR también exhibe el fenotipo albino tras el silenciamiento génico inducido por virus.De manera similar, este cultivar phyto 4 2 5 RF muestra hojas blancas en los lugares donde ha ocurrido el silenciamiento génico inducido por virus. Finalmente, esta imagen muestra otro experimento exitoso de silenciamiento génico inducido por virus, esta vez en cultivares Delta PINE 90. Al realizar este procedimiento, es importante recordar añadir acetona a los cultivos de agrobacterium antes de dejarlos sobre la mesa durante las tres horas posteriores a este procedimiento.Otros métodos como el vig, clonación de bibliotecas de ADN, pueden realizarse posteriormente para responder preguntas adicionales, como explorar funciones genéticas novedosas tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la genética vegetal exploraran la función génica y la respuesta de defensa frente a estrés abiótico y biótico en plantas cultivadas de importancia económica. Una vez dispuestos los datos, esta técnica puede realizarse en dos o tres días si se lleva a cabo adecuadamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el silenciamiento génico inducido por virus en algodón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Fuente: Shi, J., et al., Cribado e identificación de supresores silenciadores de ARN a partir de efectores secretados de patógenos vegetales. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo muestra el procedimiento para preparar un cultivo de Agrobacterium tumefaciens induciendo la expresión génica de virulencia con acetosiringona, seguida de la eliminación de antibióticos mediante lavado y resuspensión, para generar una suspensión lista para la transformación que permita la entrega génica en los tejidos...

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Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

En este trabajo presentamos el primer protocolo de infiltración localizada al vacío para estudios in vivo de la transformación genética de plantas de gran tamaño. Utilizando esta metodología, logramos por primera vez la transformación transitoria del cacao mediada por Agrobacterium in planta .

Agroinfiltración forzada al vacío para la transformación in planta de plantas recalcitrantes: el cacao como caso de estudio

Aprende el ensayo de silenciamiento génico inducido por virus mediado por Agrobacterium en algodón. Este método utiliza vectores derivados del virus del moteado del tabaco para inducir silenciamiento de RNA y estudiar la función del gen GrCLA1.

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

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