Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo

Uno de los retos del estudio del desarrollo en neurociencia es capturar morfologías dendríticas y axonales a nivel de una sola célula in vivo. En el sistema olfativo, las neuronas sensoriales olfativas extienden sus axones desde el epitelio olfativo en la nariz hasta el bulbo olfativo en el cerebro. A medida que múltiples neuronas sensoriales olfativas se proyectan hacia el bulbo olfatorio, se agrupan en paquetes.

Esto complica el estudio de las trayectorias individuales de los axones y sus morfologías terminales. Hemos desarrollado un método para visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales in vivo mediante la microinyección de una construcción de GFP. Porte lentivirus.

La transducción exitosa con lentivirus ilumina toda la longitud del axón sensorial olfativo, incluido el árbol terminal. Además de visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales, este método nos permite manipular la expresión génica de un gen particular de interés para estudiar su función en un contexto in vivo. Este procedimiento de lentivirus es de nivel de bioseguridad dos y debe realizarse en una campana de flujo laminar.

Para mantener un ambiente estéril, rocíe todo lo insertado en la campana con etanol al 70% en la campana, prepare y precaliente una cama de agua a 37 grados durante al menos 20 minutos. Antes de la inyección. Selle una bolsa de almacenamiento de plástico hasta la mitad con agua y colóquela en una incubadora de bloque calefactor vacía.

Esto permitirá que los ratones se recuperen después de la inyección. Llene un contenedor de desechos de riesgo biológico con lejía al 10% para descontaminar todo el material expuesto al virus. A partir de este procedimiento, prepare un pequeño plato abierto de etanol al 70% y un segundo plato con agua destilada estéril.

En una campana de flujo laminar, utilizaremos una jeringa Hamilton de cinco microlitros de capacidad con una aguja de calibre 33. Este modelo en particular le permite ajustar la resistencia del émbolo girando un dial de tensión ubicado en la parte superior de la cámara del émbolo. Esta característica proporciona control de volumen de microinyección para esterilizar la aguja y la cámara de la jeringa.

Aspire y expulse repetidamente el etanol del plato varias veces. Enjuague el cartucho de la jeringa aspirando y expulsando agua estéril varias veces. Coloque la jeringa a un lado seguro en la campana de flujo.

Coloque las toallitas con alcohol cerca de la estación de inyección. Prepare una etapa de inyección que proporcione una superficie elevada que facilite el posicionamiento del mouse. Se puede usar un plato de cultivo invertido de 10 centímetros cubierto con toallitas Kim.

Las crías de ratón pueden ser anestesiadas por hipotermia hasta la edad de destete. Corta un dedo de un guante de goma y coloca el cachorro de ratón en el corte de dedo. Luego colóquelo en hielo durante cinco minutos.

El guante evitará las quemaduras en la piel que se producirían por el contacto directo de la piel con el hielo, pruebe la anestesia completa al pellizcar la parte trasera y las cuatro patas del cachorro para asegurarse de que el animal no responda. Ahora estamos listos para la microinyección de lentivirus. Haremos una demostración con un cachorro neonatal.

Si se utiliza un ratón de mayor edad, se debe sustituir la aguja de calibre 33 por una aguja de calibre más grueso para penetrar en la superficie del cráneo. Esteriliza la superficie de la nariz del ratón limpiándola con una almohadilla con alcohol. Retire las existencias de lentivirus del almacenamiento en el congelador y descongele con hielo.

Hemos producido lentivirus en el laboratorio nosotros mismos utilizando métodos establecidos. Al desarrollar este método, hemos encontrado que se requiere un título viral mínimo de 10 a la novena unidad infecciosa por mil para una buena tasa de transducción. Aspire dos microlitros de solución madre de lentivirus a la jeringa Hamilton esterilizada.

Coloque el cachorro del ratón en la parte superior de la etapa de inyección. Agarra la piel de la parte superior de la cabeza a la altura de las orejas y tira suavemente hacia atrás. Hemos equipado nuestra campana de flujo con un osciloscopio de disección.

Con el fin de dirigir con precisión las microinyecciones, busque en la superficie dorsal del cráneo en el prosencéfalo un contorno del bulbo olfatorio. Nuestros objetivos de microinyección rodean estrechamente el bulbo olfativo, pero no deben incluir el bulbo en sí. Administramos cuatro inyecciones en el epitelio olfativo de cada cachorro.

Estas posiciones, representadas con puntos azules, requieren que la aguja se inserte en un ángulo dirigido medialmente. Las dos inyecciones adicionales representadas con puntos verdes son escalonadas, más medial y anteriores al bulbo olfatorio. Estas inyecciones se pueden inclinar cómodamente.

Las sugerencias de ángulos de la aguja se hacen teniendo en cuenta la posición ventral del epitelio olfatorio, que se encuentra principalmente debajo del bulbo olfatorio. Por lo tanto, el acceso perpendicular está restringido. Inserte la aguja a través de la parte superior de la cavidad nasal a unos tres milímetros por debajo de la superficie de la piel.

Para llegar al epitelio olfativo. Una mano entrenada debe sentir la caída de la resistencia cuando se alcanza el espacio luminal de la cavidad nasal. Esta área debe evitarse.

Micro inyecte 0,5 microlitros de solución madre de virus por posición. De nuevo, eligiendo dos sitios por lado, tanto a la izquierda como a la derecha, cuatro inyecciones en total de 0,5 microlitros. Cada uno por ratón significa que se necesitan dos microlitros de virus por ratón en una sola sesión de inyección.

Una vez más, tenga cuidado de no inyectar la mancha del bulbo olfativo para secar cualquier solución viral residual o sangre que pueda escapar del sitio de la inyección o de las aberturas de las fosas nasales. Con una toallita de etanol, deseche las toallitas en el recipiente blanqueado líquido diluido, coloque inmediatamente el ratón inyectado en la incubadora de lecho de agua para su recuperación. Descontamine la jeringa de aguja repitiendo el procedimiento de esterilización realizado durante la preparación. Los ratones inyectados pueden devolverse a su jaula 30 minutos después de la recuperación en la incubadora de lecho de agua.

Toda esta microinyección se puede repetir de nuevo en cuatro horas. Si desea aumentar el número de neuronas sensoriales olfativas que se infectarán, las neuronas sensoriales olfativas infectadas se pueden visualizar a lo largo de la célula en tan solo tres días. Los animales sacrificados y perfundidos para su observación en el momento deseado.

Con el fin de visualizar las trayectorias de las neuronas sensoriales olfativas unicelulares transducidas y los terminales de los axones, diseccionamos y seccionamos la corona del bulbo olfatorio con un grosor de 60 micras. Por lo tanto, la sección contendrá todas las capas celulares del bulbo olfatorio, incluidos los haces de axones de las neuronas sensoriales olfativas y los terminales de los axones, que hacen sinapsis en estructuras glomerulares unidas a la superficie del bulbo en preparación para la inmunohistoquímica flotante. Se hacen secciones seriadas del bulbo olfativo y se barren colectivamente en una placa de cultivo de 10 centímetros con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato.

Transfiera las secciones flotantes a un vial cónico de 50 mililitros. Una vez que las secciones se hayan asentado en el fondo del vial, aspire la solución salina tamponada con fosfato. Tenga cuidado de no aspirar.

Sus secciones se reponen con 10 mililitros de tampón fresco para lavar cualquier material de fijación o incrustación residual. Pipetear inmediatamente esta resuspensión en un vial cónico de 15 mililitros, asegurándose de capturar todas las secciones flotantes, aspirar la solución de enjuague y perforar las secciones con una solución de 0.3%Triton X 100 en solución salina tampón de fosfato en un lugar sobre una plataforma basculante durante 10 minutos. A temperatura ambiente, puede proceder a través de un protocolo de inmunotinción estándar en el mismo vial cónico, repitiendo los pasos de vacío y balancín según sea necesario para este tamaño de recipiente, conservando un volumen de 10 mililitros para los pasos de tinción y enjuague.

Aquí hay una lista de anticuerpos que usamos para teñir las neuronas sensoriales olfativas transducidas positivamente y la población general de neuronas sensoriales olfativas. Para una penetración completa de los anticuerpos en las secciones del bulbo de 60 micras, se recomienda incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. La profundidad de lavado tampoco debe ser inferior a 20 minutos cada uno.

Extienda suavemente cada sección en un portaobjetos de vidrio con un pincel, monte cada portaobjetos con flora Mount G complementado con una solución de tinte de cromatina. Esfuércese por eliminar todas las burbujas del medio de montaje. Monte sus secciones en filas para simplificar el paso de cribado posterior.

Escanee estas capas en las secciones del bulbo de la tinción inmunológica para las fibras axónicas y los terminales GFP positivos. Utilizando un microscopio fluorescente, las terminales nerviosas infectadas positivamente pueden ser visualizadas por microscopía confocal. Es útil calibrar el plano focal en su área de interés utilizando los canales de proteínas DPI y marcadores olfativos.

Estos resultados muestran una sola fibra axónica sensora olfativa y un axón terminal dentro del glomérulo, que es CO con proteína marcador olfativa en rojo y vlu dos en gris, cuerpos de células celulares sensoras olfativas infectadas y su protuberancia dendrítica también se puede visualizar dentro del epitelio olfativo si este tejido se incluyó en los pasos de disección e inmunotinción. Hola, mi proyección confocal nos proporciona una morfología muy detallada de una sola vía de extensión axonal de la neurona sensorial olfativa y un árbol terminal. Se puede ver el enganche de la fibra axonal hacia su objetivo glomerular, así como los detalles de su patrón de ramificación dentro de la píldora neuro glomerular.

El método de microinyección lentiviral permite la visualización de axones unicelulares, morfologías de neuronas sensoriales olfativas, y permite estudios que manipulan la expresión génica, la transducción de lentivirus da como resultado una integración genómica estable de constructos. El lentivirus no infecta transsinápticamente a las células vecinas. La visualización se puede lograr en tan solo tres días y se ha confirmado que dura al menos tres meses y probablemente persiste durante períodos más largos.

Las neuronas sensoriales olfativas no se infectan fácilmente por la infusión nasal de solución de lentivirus. Por lo tanto, se requiere microinyección a través de la superficie en este procedimiento. Así que ese es nuestro procedimiento de microinyección de lentivirus.

Espero que toda esta información te haya resultado útil para lograr morfologías unicelulares de tu propia caza feliz.