Name: Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprende a visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales in vivo mediante microinyección de lentivirus con construcción GFP. Este método permite estudiar trayectorias axonales y arborizaciones terminales en el sistema olfatorio.

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Este estudio es apoyado por el NIH y DC052256 DC006015, y NSF 0324769 de QG y T32-DC008072 a BS.

1. Preparación Este procedimiento es la bioseguridad de nivel 2, por lo tanto, todos los preparativos se hacen las siguientes en una campana de riesgo biológico donde se realiza el procedimiento de microinyección. <ol><li> Preparar y precalentamiento a 37 ° C cama de agua: Llene una bolsa de plástico con agua - sello y situado en un bloque vacío de calefacción incubadora. Esto permitirá que los ratones a recuperarse después de la inyección. </li><li> Llenar un recipiente para residuos biológicos peligrosos con lejía al 10% a un volumen adecuado para la inmersión de todos los residuos de este procedimiento. </li><li> Prepare un plato pequeño abierto de etanol al 70% y un segundo plato con ddH2O esterilizado y el lugar en el gabinete de seguridad biológica. </li><li> Esterilizar una capacidad 5μL jeringa Hamilton con una aguja de calibre 33 rociando el cuerpo y la aguja con el 70% de etanol con el émbolo se retiró todo el camino. Repetidamente aspirado etanol a partir de la antena y expulsar todo el camino por lo menos 5 veces. </li><li> Enjuague el cartucho de la jeringa con agua estéril de aspiración y extracción de al menos 5 veces. Coloque la jeringa de forma segura a un lado de la campana de la cultura y deje que se seque. </li><li> Eliminar los stocks de virus de -80 ° C y almacenamiento en el congelador en lugar de hielo para permitir la descongelación. Microinyección requiere 2μL del stock de virus por ratón con un título de 10 9 unidades infecciosas / ml. Los lentivirus se puede obtener de fuentes comerciales o producidos en el laboratorio de acuerdo con el protocolo establecido (Lois et al., 2002). </li><li> Prepare una etapa de inyección que proporciona una zona elevada por encima de la superficie de la campana - puede utilizar una placa de cultivo de 10 cm cubierto con una sábana de Kimwipe. </li><li> Organizar toallitas con alcohol cerca de la estación de inyección. </li></ol> 2. Microinyección de partículas lentiviral en el epitelio olfatorio Todos los procedimientos de animales que hayan realizado en este método se realiza de acuerdo con las directrices aprobadas IACUC. El Mus musculus cepa C57BL/6J es el modelo animal utilizado en todos los experimentos se demuestra aquí. <ol><li> Anestesiar a crías de ratón por la hipotermia, a una cría de ratón (P0-P3) fuera de la jaula y poner el cachorro en un guante de corte abierto en el hielo durante 5 minutos. </li><li> A la espera de que el cachorro a estar completamente anestesiado, 2μL aspirado de las acciones virales en el esterilizado jeringa Hamilton. </li><li> Coloque la cría de ratón en la parte superior de la fase de inyección. Tire suavemente de la piel lejos de la parte superior de la cabeza en el oído hacia la parte superior del cuello. Esto debería proporcionar una superficie de la piel impartidas a través de la cavidad nasal y la facilidad de la inyección. </li><li> Inserte la aguja a través de la parte superior de la cavidad nasal de aproximadamente 3 mm por debajo de la superficie de la piel para alcanzar el epitelio olfativo. Microinject 0.5μL de la solución de virus por disparo, la elección de dos sitios por cada lado, izquierdo y derecho (cuatro inyecciones total por ratón = 2μL de virus es necesario). Los puntos de inyección deben ser escalonadas separados unos de otros. Para la selección de los sitios de inyección adecuada, buscar en la superficie del cráneo dorsal para el contorno del bulbo olfatorio. Esta línea es apenas visible en el nacimiento a través de la piel semi-transparente y el cráneo. Para que dos inyecciones por cada lado, el objetivo de una inyección justo rostral al bulbo de un esquema en un eje medial. Hacer la segunda inserción lateral al contorno del bulbo, sin embargo, asegúrese de que el ángulo de la inyección medial de modo que usted puede alcanzar el epitelio olfativo que se encuentra debajo de la parte ventral del bulbo. Evitar penetrar en el bulbo olfatorio! </li><li> Seque cualquier solución de virus o de la sangre residual que puede escapar de la zona de inyección o aberturas ventana de la nariz con un Kimwipe. Deseche inmediatamente Kimwipes en el recipiente de líquido blanqueador diluido riesgo biológico. </li><li> Coloque el ratón inyectado en la cama de agua incubadora. </li><li> Repita los pasos 1-4 para todos los ratones que se inyecta, recordando que se necesitan alrededor de 2μL del stock de virus por ratón. </li><li> Vamos a recuperar los ratones en la cama de agua incubadora durante 30 minutos antes de volver a su jaula de anidación original. </li><li> Disponer de la etapa de la microinyección, toallitas desinfectantes y productos de limpieza adicional de papel en la eliminación de cloro líquido de riesgo biológico. </li><li> Limpie la jeringa Hamilton por la aspiración repetida y la expulsión de etanol y agua como se hizo en los pasos de preparación. Dejar que la jeringa que se seque. </li><li> Para máxima eficiencia de transducción repetir de nuevo este procedimiento en 4 horas. OSN infectada puede ser visualizado a lo largo de la célula en tan sólo tres días. </li></ol> 3. Inmunohistoquímica de secciones flotantes bulbo olfatorio <ol><li> El sacrificio del ratón inyectado en el punto en el tiempo deseado y fijar la perfusión del tejido con paraformaldehído al 4%. Diseccionar el OB. Incubar en paraformaldehído durante la noche y del 30% de sacarosa en PBS durante la noche. Insertar en el medio de inclusión octubre en hielo seco. </li><li> Coronal secciones OB se obtienen en un 60μm de espesor con un criostato. Barrido secciones bombilla en una placa de cultivo de 10 cm con 5 ml de PBS 1x (pH 7,4). Las secciones deben mantenerse flotando en PBS para permitir a octubre dissolve. Transferencia de las secciones flotantes y PBS en un vial de 50 ml cónicos. </li><li> Permitir que las secciones que se depositan en el fondo del vial. Vacío de PBS sin aspirar a ninguna de las secciones. Enjuague las secciones de tejido con 20 ml de PBS. Repita los pasos asentarse y pasar la aspiradora. Tejido resuspender con 10 ml de PBS y las secciones de transferencia flotante a un vial de 15 ml cónicos de inmunotinción. Una vez que las secciones de tejido se han asentado, el vacío de PBS sobrenadante sin alterar los tejidos. Volver a suspender las secciones con el 0,3% Triton X-100 en 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) que permite detergente para perforar las membranas celulares. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y repetir la incubación con PBS-Tx dos veces. </li><li> Incubar las secciones de tejido en 10 ml de solución de bloqueo (5% suero de caballo en PBS-Tx) durante dos horas a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague la solución de bloqueo por lo menos dos veces con PBS-Tx durante 15 minutos cada una a temperatura ambiente. </li><li> Prepare 2 ml de una solución de anticuerpo primario en PBS-Tx. Vea la sección de Reactivos y Equipos para los anticuerpos utilizados en este experimento. </li><li> Vuelva a colocar segundo PBS-Tx lavado de bloqueo con la solución de anticuerpo primario. Incubar en una plataforma lenta oscilación (~ 30rpm) a 4 ° C durante 24-48 horas para asegurar la penetración a fondo de las secciones flotantes 60μm. </li><li> Después de la incubación, la solución de anticuerpo primario puede ser recuperada cuidadosamente con una pipeta y se almacenan a 4 ° C para su reutilización hasta dos veces más dentro de dos semanas sin una pérdida significativa de la intensidad de la tinción. </li><li> Lávese las secciones tres veces en PBS-Tx durante 20 minutos cada una a temperatura ambiente con una rotación suave (~ 30rpm). </li><li> Prepare 2 ml de la dilución del anticuerpo secundario en PBS-Tx. Aspire el último lavado y agregar la solución de anticuerpo secundario a las secciones de tejido. Envuelva el exterior de la cubeta de tinción en papel de aluminio para bloquear la luz, que puede causar photobleaching fluoróforo. Lugar envuelto en una plataforma vial lentamente balanceándose e incubar a 4 ° C durante la noche. </li><li> Desechar la solución secundaria de anticuerpos con la aspiradora de distancia. Lávese las secciones de una vez con PBS-Tx durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague dos veces más con PBS (pH 7,4) durante 20 minutos cada una a temperatura ambiente. Montaje de las secciones de tejidos teñidos en portaobjetos de vidrio con Fluoromount G. </li><li> Pantalla a través de las secciones teñidas positivamente para los axones OSN infectados y terminales de axón con un microscopio de fluorescencia. </li><li> Para construir una visión tridimensional de una etiqueta axón OSN y cenador terminal, hacer una serie de secciones ópticas a través de la profundidad de 60μm de la división de destino tejido OB (a lo largo del eje z) mediante microscopía confocal. </li><li> Esta pila de sección Z imágenes posteriormente se pueden proyectar juntos para reconstruir una perspectiva de 360 ​​º de rotación de una sola etiqueta axón OSN, incluyendo terminales de detalle jardín en su totalidad. Cualquier ángulo de rotación de una sola puede ser capturado y exportado como un archivo de imagen (es decir, JPG, TIFF) para su presentación en formato 2D. </li></ol> 4. Resultados representante Con los métodos descritos aquí, podemos transducir neuronas sensoriales olfativas por lentivirus en vivo. De esta manera hemos OSN infectados ahora visualiza con las buenas prácticas agrarias y los periodistas mCherry fluorescentes, así como con un myc-etiquetados proteína de fusión a través de inmunocitoquímica. Esta técnica proporciona una abundancia de OSN infectados. Sin embargo, la transducción se presenta esporádicamente suficiente para proporcionar OSN etiquetados individualmente, lo que permite el análisis de la morfología de las células individuales. Axones y terminales de los axones son expuestas en las secciones de tejido OB en medio de su ambiente natural por microscopía confocal (Figura 1). Toda la OSN axón terminal jardín típicamente puede ser cautivado dentro de una sección óptica de 40-50 micras. Gran aumento de infectados terminales de los axones OSN permite un análisis detallado de la morfología axonal árbol en la capa glomerular. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figura 1. Trayectoria de una sola neurona olfativa sensorial axón y su terminal de árbol. A) una sección coronal del bulbo olfativo de un ratón P7 que muestra la capa del nervio olfatorio (ONL) immunostained de OMP (rojo) y la capa glomerular (GL) immunostained con ambas OMP y Vglut2 (gris). Un solo axón olfatorio neuronas sensoriales que expresan GFP (verde) se mueve dentro de la ONL y penetra en la estructura glomerular. B) El axón terminal de la morfología de jardín dentro del glomérulo claramente de manifiesto en la expresión de GFP. Vglut2 co-tinción de color gris ilumina la superficie total glomular en el que la GFP-positivas axones elabora un aborto terminal. C) lentivirales OSN infectadas que expresan GFP (verde) en el entorno operativo. El cytostructure del epitelio olfativo se muestra con DAPI (azul). La expresión de GFP permite la visualización de los cuerpos celulares de OSN y sus procesos celulares en el entorno operativo. D) Un axón OSN y su morfología terminal con Rap1GAP2 expresión derribo por shRNA. Los lentivirus llevar un cassette de expresión con doble Rap1GAP2 ARNhc bajo el promotor del ratón U6 y las buenas prácticas agrarias con unPromotor de CMV se aplicaron a la OE. Infectados terminales de los axones olfativos exhibió un terminal más simple glorieta en comparación con la del control de las buenas prácticas agrarias solamente. Bar = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Este protocolo es de bioseguridad nivel 2 compatible. Todas las medidas de los residuos del área de trabajo adecuada, protección personal, y virales de contención se han establecido en consecuencia. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo a las directrices de IACUC.

Microinyección de lentivirus resultados en la transferencia permanente de construcciones de genes en el ADN genómico OSN. Este enfoque nos permite realizar manipulaciones a corto plazo oa largo plazo de genes candidatos a través de la sobreexpresión o mediados del shRNA knock-down. Además, se pueden etiquetar con fluorescencia OSN solo en una línea de ratones transgénicos existentes para observar la co-localización de las poblaciones de receptores odoríferos. Microinyección es necesaria para la transducción lentiviral d...

Microinyección: Los ratones recién nacidos fueron microinyección con una jeringa Hamilton 5μL (Hamilton # 7647-01) equipado con una aguja de calibre 33 (Hamilton # 7762-06). Inmunocitoquímica Reactivos: Los anticuerpos primarios: GFP anticuerpo policlonal de conejo (Molecular Probes # A-6455), el anticuerpo policlonal de pollo en contra de OMP (personalizado) (Chen et al, 2005.), Guinea anticuerpo policlonal de cerdos contra la VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticuerpos secundarios: Cy2-burro conjugado anti-conejo (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-burro conjugado anti-pollo (Jackson Immunolab # 703-165-155) y Cy5-conjugado de cabra anti-conejillo de indias (Jackson Immunolab # 106-175-008). Las secciones fueron montadas en portaobjetos de vidrio con Fluoromount G (Southern Biotech # 0010 a 01) con la solución de DAPI 50ng/mL cromatina mancha. Microscopía confocal: Z-stack imágenes fueron tomadas con una Olympus FV1000 Flouview microscopio confocal e imágenes recogidos y tratados en las proyecciones en 3D usando las baterías Olympus FV10-ASW adquisición de 2,01 confocal y análisis de software.

lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Desarrollo de un circuito olfativo precisa se basa en la proyección exacta de las neuronas sensoriales olfativas (OSN), los axones hacia sus objetivos sináptica en el bulbo olfatorio (OB). Los mecanismos moleculares de la OSN crecimiento de los axones y la selección no se comprenden bien. Manipulación de la expresión génica y posterior visualización de los axones OSN único y su morfología terminal de jardín hasta el momento han sido todo un desafío. Para estudiar la función génica en el nivel de células individuales dentro de un plazo determinado, hemos desarrollado una técnica basada en lentiviral para manipular la expresión génica en OSN en vivo. Partículas lentiviral se entregan a OSN por microinyección en el epitelio olfatorio (EO). Casetes de expresión de forma permanente se integra en el genoma de la OSN transducidas. Expresión de la proteína fluorescente verde identifica OSN infectados y describe su morfología completa, incluido el jardín axón terminal. Debido a los plazos de entrega cortos entre la microinyección y la detección de periodista, los estudios de la función genética se puede enfocar en un plazo muy limitado de desarrollo. Con este método, se ha detectado la expresión de GFP en tan sólo tres días y hasta tres meses después de la inyección. Hemos logrado por la sobre-expresión y del shRNA mediada por knock-down por microinyección lentiviral. Este método proporciona morfologías detallada de los cuerpos celulares y axones OSN en el nivel de células individuales en vivo, y por lo tanto permite la caracterización de la función de genes candidatos durante el desarrollo del olfato.

Se presenta una técnica de lentivirus de la manipulación genética y la visualización de un solo axón neuronas sensoriales olfativas y su arborización terminal de<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

El desarrollo de un circuito olfativo preciso depende de la proyección exacta de los axones de las neuronas sensoriales olfativas (NSO) hacia sus dianas sinápticas en el...

Uno de los desafíos del estudio del desarrollo en neurociencia consiste en capturar las morfologías dendríticas y axónicas a nivel de una sola célula in vivo. En el sistema olfativo, las neuronas sensoriales olfativas extienden sus axones desde el epitelio olfativo en la nariz hasta el bulbo olfativo en el cerebro. A medida que múltiples neuronas sensoriales olfativas proyectan hacia el bulbo olfativo, se agrupan en haces.Esto complica el estudio de las trayectorias individuales de los axones y sus morfologías terminales. Hemos desarrollado un método para visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales in vivo mediante la microinyección de un constructo GFP portador de lentivirus.La transducción exitosa con lentivirus ilumina toda la longitud del axón sensorial olfativo, incluyendo el arbor terminal. Además de visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales, este método nos permite manipular la expresión génica de un gen de interés determinado para estudiar su función en un contexto in vivo. Este procedimiento con lentivirus requiere un nivel de bioseguridad dos y debe realizarse en una cabina de flujo laminar.Para mantener un ambiente estéril, rocíe con etanol al 70 % todo lo que se introduzca en la cabina, prepare y precaliente una camilla de agua a 37 grados durante al menos 20 minutos antes de la inyección. Selle una bolsa de plástico semillena con agua y colóquela sobre un bloque calefactor vacío del incubador.Esto permitirá que los ratones se recuperen tras la inyección. Llene un recipiente para residuos biopeligrosos con lejía al 10% para descontaminar todos los materiales expuestos al virus. A partir de este procedimiento, prepare un pequeño recipiente abierto con etanol al 70% y un segundo recipiente con agua destilada estéril.En una cabina de flujo laminar, utilizaremos una jeringa Hamilton con una capacidad de cinco microlitros y una aguja de calibre 33. Este modelo en particular permite ajustar la resistencia del émbolo girando un dial de tensión ubicado en la parte superior de la cámara del émbolo. Esta característica proporciona control del volumen de microinyección y permite esterilizar la aguja y la cámara de la jeringa.Aspire y expulse etanol de la placa varias veces repetidamente. Enjuague el cartucho de la jeringa aspirando y expulsando agua estéril varias veces. Coloque la jeringa de forma segura a un lado dentro de la cabina de flujo.Coloque toallitas con alcohol cerca del puesto de inyección. Prepare una plataforma de inyección que ofrezca una superficie elevada y facilite la colocación del ratón. Puede utilizarse una placa de cultivo de 10 centímetros invertida, cubierta con toallitas Kim.Las crías de ratón pueden anestesiarse mediante hipotermia hasta la edad de destete. Recorte un dedo de un guante de látex y coloque la cría de ratón dentro del corte del dedo. Luego, colóquelo sobre hielo durante cinco minutos.El guante evitará quemaduras en la piel que ocurrirían por contacto directo con el hielo. Realice la prueba de anestesia completa pellizcando las patas traseras y delanteras del cachorro para asegurarse de que el animal no responda. Ahora estamos listos para la microinyección del lentivirus. Realizaremos la demostración con un cachorro neonato.Si se utiliza un ratón de mayor edad, se debe sustituir la aguja de calibre 33 por una aguja de calibre más grueso para poder atravesar la superficie del cráneo. Esterilice la superficie nasal del ratón pasando un torunda con alcohol. Saque los stocks de lentivirus del congelador y descongele sobre hielo.Hemos producido lentivirus en el laboratorio por nosotros mismos utilizando métodos establecidos. Al desarrollar este método, hemos encontrado que se requiere una titulación viral mínima de 10 a la novena unidades infecciosas por mililitro para obtener una buena tasa de transducción. Aspire dos microlitros de la solución stock de lentivirus hacia la jeringa esterilizada de Hamilton.Coloque la cría de ratón encima de la plataforma de inyección. Sujete la piel de la parte superior de la cabeza a la altura de las orejas y tire suavemente hacia atrás. Hemos equipado nuestra cabina de flujo laminar con un microscopio estereoscópico.Para dirigir con precisión las microinyecciones, busque en la superficie dorsal del cráneo en la región del prosencéfalo el contorno del bulbo olfatorio. Nuestros objetivos de microinyección rodean estrechamente el bulbo olfatorio, pero no deben incluir el propio bulbo. Realizamos cuatro inyecciones en el epitelio olfatorio de cada cría.Estas posiciones representadas con puntos azules requieren que la aguja se inserte en un ángulo dirigido medialmente. Las dos inyecciones adicionales representadas con puntos verdes están escalonadas, más medial y anterior al bulbo olfatorio. Estas inyecciones pueden angulase ligeramente hacia abajo.Las sugerencias sobre los ángulos de la aguja se hacen considerando la ubicación ventral del epitelio olfativo, que se sitúa principalmente debajo del bulbo olfativo. Por lo tanto, el acceso perpendicular está restringido. Inserte la aguja a través de la parte superior de la cavidad nasal aproximadamente tres milímetros por debajo de la superficie de la piel.Para llegar al epitelio olfativo. Una mano entrenada debe percibir la disminución de la resistencia cuando se alcanza el espacio luminal de la cavidad nasal. Esta área debe evitarse.Microinyectar 0,5 microlitros de la solución vírica por posición. Nuevamente, eligiendo dos sitios por lado, tanto izquierdo como derecho, un total de cuatro inyecciones de 0,5 microlitros. Cada uno por ratón significa que se necesitan dos microlitros de virus por ratón en una sola sesión de inyección.Nuevamente, tenga cuidado de no inyectar el bulbo olfatorio seco ni cualquier solución viral residual o sangre que pueda escapar del sitio de inyección o de las aberturas nasales. Usando una toallita con etanol, deseche las toallitas en el recipiente con lejía diluida e inmediatamente coloque el ratón inyectado en la incubadora de cama de agua para su recuperación. Descontamine la jeringa con aguja repitiendo el procedimiento de esterilización realizado durante la preparación. Los ratones inyectados pueden regresarse a su jaula 30 minutos después de la recuperación en la incubadora de cama de agua.Esta microinyección completa puede repetirse nuevamente en cuatro horas. Si desea aumentar el número de neuronas sensoriales olfativas que serán infectadas, las neuronas sensoriales olfativas infectadas pueden visualizarse a lo largo de toda la longitud de la célula en tan solo tres días. Los animales se sacrifican y perfunden para su observación en el momento deseado.Utilizando métodos estándar para visualizar las trayectorias de neuronas sensoriales olfativas transducidas a nivel de célula individual y los terminales axónicos, diseccionamos y seccionamos el bulbo olfativo en cortes coronales de 60 micrones de grosor. Así, el corte contendrá todas las capas celulares del bulbo olfativo, incluyendo haces de axones de neuronas sensoriales olfativas y terminales axónicos, que forman sinapsis en estructuras glomerulares ubicadas en la superficie del bulbo, en preparación para la inmunohistoquímica en flotación. Se realizan cortes seriados del bulbo olfativo y se recogen colectivamente en una placa de cultivo de 10 centímetros con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato.Transfiera las secciones flotantes a un vial cónico de 50 mililitros. Una vez que las secciones hayan sedimentado en el fondo del vial, aspire la solución salina tamponada con fosfato. Tenga cuidado de no aspirar las secciones.Sus secciones se reponen con 10 mililitros de tampón fresco para eliminar cualquier fijador residual o material de inclusión. Inmediatamente, aspire esta suspensión y transfiérala a un vial cónico de 15 mililitros, asegurándose de recuperar todas las secciones flotantes, retire por succión la solución de lavado y permeabilice las secciones con una solución de 0,3 % de Triton X-100 en tampón salino fosfato, colocando el vial en una plataforma agitadora durante 10 minutos. A temperatura ambiente, puede continuar entonces con un protocolo estándar de inmunotinción en el mismo vial cónico, repitiendo los pasos de succión y agitación según sea necesario para este tamaño de recipiente, manteniendo un volumen de 10 mililitros para las etapas de tinción y lavado.A continuación se muestra una lista de los anticuerpos que utilizamos para teñir conjuntamente neuronas sensoriales olfativas positivas para la transducción y la población general de neuronas sensoriales olfativas. Para una penetración completa de los anticuerpos en cortes de bulbo de 60 micrones, se recomienda una incubación nocturna a cuatro grados Celsius. Además, cada lavado debe tener una duración mínima de 20 minutos.Extienda suavemente cada sección sobre un portaobjetos de vidrio con un pincel y monte cada portaobjetos con FloraMount G suplementado con solución de tinción de cromatina. Haga esfuerzos por eliminar todas las burbujas del medio de montaje. Monte sus secciones en filas para facilitar el paso posterior de cribado.Analice estas capas en sus secciones de bulbo inmunomarcadas en busca de fibras axonales y terminaciones positivas para GFP. Utilizando un microscopio fluorescente, las terminaciones nerviosas positivas pueden ser entonces observadas mediante microscopía confocal. Es útil calibrar el plano focal en su área de interés utilizando los canales de DPI y de la proteína marcadora olfativa.Estos resultados muestran una única fibra axonal y terminal axonal de una neurona sensorial olfativa dentro del glomérulo, que es CO con la proteína marcadora olfativa en rojo y vlu dos en gris. Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales olfativas infectadas y sus botones dendríticos también pueden visualizarse dentro del epitelio olfativo si este tejido se incluyó en los pasos de disección y inmunomarcado. Mi proyección confocal nos proporciona una morfología altamente detallada del trayecto de extensión axonal y del arbor terminal de una única neurona sensorial olfativa. Puede observarse el doblado del axón hacia su objetivo glomerular, así como los detalles de su patrón de ramificación dentro del neuropilo glomerular.El método de microinyección de lentivirus permite la visualización de axones individuales, las morfologías de las neuronas sensoriales olfativas y posibilita estudios que manipulan la expresión génica; la transducción con lentivirus da como resultado la integración genómica estable de los constructos. El lentivirus no infecta transsinápticamente las células vecinas. La visualización puede lograrse en tan solo tres días y se ha confirmado que dura al menos tres meses, y probablemente persiste durante períodos más largos.Los neuronas sensoriales olfativas no se infectan fácilmente mediante la infusión nasal de una solución de lentivirus. Por lo tanto, en este procedimiento es necesario realizar una microinyección a través de la superficie. Ese es nuestro procedimiento de microinyección de lentivirus.Espero que toda esta información le haya resultado útil para lograr morfologías de células individuales. Que tenga buena suerte en su búsqueda.

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Neurociencia

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Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

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Describimos un protocolo para el marcaje in vivo de neuronas sensoriales olfativas mediante electroporación y posterior escaneo láser confocal o microscopía multifotónica para visualizar la morfología neuronal y su desarrollo a lo largo del tiempo.

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Aquí describimos un procedimiento basado en el uso de partículas lentivirales para la modificación genética a largo plazo de células madre neurales y/o sus células ependimarias adyacentes en el nicho neurogénico ventricular-subventricular adulto que permite el análisis por separado de los efectos autónomos y no autónomos, dependientes del nicho, sobre las células madre neurales.

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El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.

Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .

Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana

Aprende a visualizar neuronas sensoriales olfativas individuales in vivo mediante microinyección de lentivirus con construcción GFP. Este método permite estudiar trayectorias axonales y arborizaciones terminales en el sistema olfatorio.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo

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