Enriquecimiento de fosfopéptidos a base de dióxido de titanio: un método para el aislamiento selectivo de fosfopéptidos de la biblioteca de péptidos

Los fosfopéptidos son cadenas cortas de aminoácidos que contienen residuos de serina, treonina o tirosina fosforilada. Para aislar los fosfopéptidos de una mezcla de péptidos, comience tomando perlas de dióxido de titanio en un tubo. Equilibre para acondicionar las perlas utilizando un tampón aglutinante acidificado adecuado que contenga un agente de enfriamiento. Agregue la concentración deseada de mezcla de péptidos a la suspensión de perlas.

Incube la mezcla agitando continuamente para evitar que las perlas se asienten. La condición ácida promueve que el grupo fosfato de los fosfopéptidos forme enlaces coordinados con las perlas de titanio. El agente de enfriamiento en el tampón reduce cualquier unión inespecífica de péptidos no fosforilados a las perlas, dejándolos en suspensión.

Centrifugar para peletizar las perlas unidas a fosfopéptidos, mientras que los péptidos no fosforilados permanecen en el sobrenadante. Deseche el sobrenadante. Transfiera las perlas unidas a fosfopéptidos a una columna de filtro giratorio preensamblada. Centrifugar para eliminar el tampón de unión y atrapar las perlas conjugadas con fosfopéptido.

Transfiera el filtro a un tubo limpio y agregue una solución que contenga amoníaco. El amoníaco hace que la suspensión sea básica, lo que hace que los fosfopéptidos se desenganchen de las perlas. Centrifugar el conjunto para eluir y recoger los fosfopéptidos no unidos. Las perlas de dióxido de titanio permanecen en el cartucho del filtro. Seque los fosfopéptidos para eliminar cualquier rastro de amoníaco.

Preacondicione el dióxido de titanio con 500 microlitros de ACN 100% dos veces. Luego, acondicione el dióxido de titanio con 500 microlitros de tampón de fosfato de sodio 0.2 M, pH 7, dos veces. Finalmente, use 300 microlitros de tampón de equilibrio para lavar las perlas tres veces. Agregue 400 microlitros de 50% de ACN, 0.1% de TFA al tubo de baja unión a proteínas. Luego, agregue 84 microlitros de ácido láctico.

Transfiera los fosfopéptidos resuspendidos al tubo de baja unión a proteínas e incube a temperatura ambiente con un rotador de extremo a extremo durante 1 hora. Después de granular las perlas, use 300 microlitros de tampón de equilibrio para lavarlas dos veces y centrifugarlas. Con 300 microlitros de tampón de enjuague, enjuague las perlas dos veces. Luego, transfiéralos a un filtro de centrifugación de 0,2 micrómetros.

Después de centrifugar, transfiera la unidad de filtro a un tubo limpio de baja unión a proteínas de 1,5 mililitros y, con 200 microlitros de amonio al 0,9% en agua, eluya el contenido dos veces. Después de verificar el pH, concentre al vacío el eluido hasta que se seque durante la noche para evaporar el amoníaco.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
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