Aislamiento peritoneal de neutrófilos de baja densidad: una técnica para obtener neutrófilos de baja densidad a partir de líquido de lavado peritoneal mediante la clasificación de células activadas magnéticamente

Los neutrófilos de baja densidad, o LDN, son una subpoblación distinta de neutrófilos que se encuentra en cantidades elevadas durante condiciones patológicas como el cáncer gastrointestinal. Los LDN se pueden aislar de los lavados de la cavidad peritoneal o del líquido de lavado de los pacientes.

Primero, filtre el líquido de lavado para eliminar los restos de tejido. Centrifugar el filtrado para obtener un gránulo que contenga células sanguíneas, incluidas las LDN. Volver a suspenderlo en un tampón adecuado. Coloque esta suspensión sobre un medio de gradiente de densidad adecuado óptimo para el aislamiento de LDN.

Centrifugar para separar los diferentes componentes sanguíneos en función de sus densidades relativas. Los glóbulos rojos más densos forman la capa inferior, mientras que la fracción plasmática menos densa forma la capa superior. Las LDN menos densas ocupan la capa intermedia junto con otras células mononucleares.

Transfiera la capa intermedia a un tubo nuevo que contenga un reactivo de bloqueo. Los componentes del reactivo bloquean los sitios de unión no específicos en todas las superficies de las células no diana y aumentan la especificidad de la LDN durante el etiquetado posterior.

Agregue microperlas conjugadas con anticuerpos dirigidas a una molécula específica de la superficie celular sobreexpresada en LDN. Incube para que los complejos de perlas de anticuerpos se unan a sus moléculas diana en LDN.

Pasar la suspensión incubada a través de una columna colocada en un campo magnético. Bajo la influencia magnética, todos los complejos de microperlas de LDN se adhieren a la pared de la columna mientras pasan las células no marcadas.

Elimine la columna. Enjuague el contenido con un tampón adecuado para eluir y recoger la fracción que contiene LDN.

Para adquirir los neutrófilos, primero, infunda 1 litro de solución salina estéril normal inmediatamente antes del cierre de la herida directamente en la cavidad abdominal de un paciente que acaba de someterse a una cirugía abdominal debido a una neoplasia maligna gastrointestinal, y lave la cavidad abdominal extensamente durante al menos 1 minuto. Luego, revuelva la solución salina dentro de la cavidad y recupere 200 mililitros de líquido de lavado con cuatro jeringas de 50 mililitros.

En el laboratorio, transfiera el líquido de lavado peritoneal a través de un filtro de nailon de 100 micrómetros a tubos individuales de 50 mililitros para centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en 5 mililitros de PBS suplementados con EDTA al 0,02% y superponga cuidadosamente cada suspensión celular en 3 mililitros de solución de gradiente de densidad. Después de la separación del gradiente de densidad, recolecte de 2 a 3 mililitros de la capa intermedia de cada tubo y lave las muestras de líquido peritoneal en 10 mililitros de PBS fresco más EDTA por tubo. Vierta los gránulos en 10 mililitros de PBS fresco más EDTA para un lavado adicional y diluya las células a una concentración de tampón de 1 por 10 a la séptima por 60 micrómetros de clasificación de células activadas magnéticamente, o MACS.

Bloquee cualquier unión no específica con 20 microlitros de bloque Fc durante 10 minutos a 4 grados centígrados, seguido de la adición de 20 microlitros de perlas magnéticas anti-CD66b. Después de 10 minutos a 4 grados centígrados, lave y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de tampón MACS y agregue las células a una columna magnética de tamaño adecuado dentro del campo magnético de un separador magnético adecuado. Cuando todas las células negativas CD66b hayan pasado por la columna, agregue 15 mililitros de tampón MACS nuevo al depósito de la columna y transfiera la columna del separador magnético a un nuevo tubo cónico. Luego, sumerja inmediatamente la columna para enjuagar el positivo CD66b marcado magnéticamente en el tubo.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.