Tinción negativa de exosomas purificados: un procedimiento para visualizar la morfología de los exosomas mediante microscopía electrónica de transmisión

Para realizar la tinción negativa de exosomas (vesículas esféricas de tamaño nanométrico), comience tomando una rejilla de microscopía electrónica adecuada. Prepara la rejilla con un descargador de brillo. Este proceso hace que la superficie de la rejilla sea hidrófila para una mejor adhesión de las muestras.

Simultáneamente, tome una suspensión de exosomas purificados en un tubo. Complemente el tubo con paraformaldehído, un fijador de muestras, e incube. El paraformaldehído penetra en los exosomas y reticula las proteínas y los ácidos nucleicos. Este paso es vital para preservar la morfología de los exosomas.

Ahora, cargue la suspensión del exosoma en la rejilla preparada previamente e incube para permitir que se produzca la adsorción. A continuación, agregue unas gotas de acetato de uranilo, una mancha de metal pesado, sobre la rejilla. Los iones de uranilo se unen a las proteínas y lípidos de la membrana, formando un depósito alrededor del límite del exosoma.

Por último, lave la rejilla con agua para eliminar el exceso de mancha. Deje que la rejilla se seque y obtenga imágenes con microscopía electrónica de transmisión o TEM.

Cuando un haz de electrones golpea los exosomas, la mancha que rodea la muestra dispersa más electrones. Los exosomas, al ser menos densos en electrones, permiten que el haz pase a través. Estos electrones dispersos de manera diferente son capturados por el sistema de imágenes para formar una imagen de alto contraste.

Los exosomas teñidos negativamente parecen más claros, con un límite oscuro a su alrededor.

Para realizar la tinción negativa, fije los exosomas purificados después del aislamiento con 1 mililitro de paraformaldehído al 2% durante 5 minutos. Trate las rejillas EM de cobre de malla 200 recubiertas de película de carbono delgada con descarga incandescente durante 1 minuto. Luego, cargue de 5 a 7 microlitros de la solución de suspensión de exosomas en una rejilla e incube durante 1 minuto. Si la concentración de exosoma es demasiado alta, diluya la concentración a un nivel adecuado.

Inmediatamente, tiña los exosomas con unas 20 gotas de una solución filtrada de acetato de uranilo al 1% en la superficie de la rejilla EM. Retire el exceso de solución de acetato de uranilo de la rejilla haciendo contacto con el borde de la rejilla con papel de filtro. Luego, enjuague rápidamente la rejilla con una gota de agua.

Use un par de pinzas para colocar la rejilla sobre la mesa y cubra la rejilla parcialmente con una placa de cultivo. Deje que la rejilla se seque durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego obtenga una imagen de la rejilla o guárdela en una caja de rejilla de microscopio electrónico para futuras observaciones.