Establecimiento de un modelo de cocultivo tridimensional de ganglios de raíz dorsal murina y células cancerosas: un modelo in vitro para estudiar la invasión de células cancerosas perineurales

La invasión perineural o PNI se refiere a la migración de células cancerosas a lo largo de los nervios y su posterior invasión al perineuro, un microambiente adecuado para el crecimiento y la metástasis del cáncer.

Para imitar la PNI in vitro, comience agregando una gota de matriz extracelular o suspensión de ECM en una placa de cultivo de modo que tome la forma de un hemisferio. Ahora, incube la placa de cultivo para reforzar las características estructurales y funcionales del andamio 3D.

A continuación, coloque con cuidado un ganglio de la raíz dorsal o DRG previamente cosechado, un grupo de neuronas sensoriales, en el centro de la gota semisólida de ECM. Incubar para incrustar el DRG dentro de la gota de ECM.

A continuación, agregue un medio de cultivo adecuado e incube. La ECM suplementada con nutrientes favorece la germinación de DRG en pequeñas proyecciones nerviosas llamadas neuritas que crecen radialmente hacia la circunferencia de la gota.

Retire el medio gastado para preparar la gota de ECM para el ensayo posterior. La semilla tiñe fluorescentemente las células cancerosas adherentes sobre la gota. Debido a la forma hemisférica, las células cancerosas se dan la vuelta y se asientan a lo largo de la periferia de las gotas.

Incube la placa de cultivo para permitir la interacción entre células cancerosas y neuritas. Cuando se observan bajo el microscopio de fluorescencia, se puede ver que las células cancerosas se desplazan junto con las neuritas y migran hacia el DRG, lo que confirma la invasión perineural.

Para preparar las gotas de matriz semisólida, transfiera una placa de vidrio con fondo de pocillo del hielo a un bloque de hielo bajo el microscopio quirúrgico. Coloque la punta de una pipeta de no más de 10 microlitros directamente sobre el vidrio en un ángulo de 45 grados y dispense con cuidado una gota de matriz de 1,5 microlitros sobre el vidrio. Aleje lentamente la punta de la pipeta del vidrio a medida que la matriz se enganche con la placa.

Deposite una gota de matriz en cada una de las cuatro esquinas de la placa y transfiérala a una superficie a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 minuto. Cuando la matriz se haya endurecido ligeramente, regrese la placa al bloque de hielo y use pinzas microscópicas cerradas para recoger el DRG suavemente con la mano izquierda.

Con la mano derecha, transfiera con cuidado el tejido nervioso a la punta de una aguja 21G y use la aguja para insertar suavemente el DRG en el medio de la gota de la matriz. El DRG debe liberarse fácilmente en la matriz para colocarlo en el centro con la aguja.

Después de insertar una pieza de DRG en cada una de las cuatro gotas, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 3 minutos. Cuando se hayan incrustado todos los DRG, sostenga las placas una a la vez en un ligero ángulo y agregue lentamente 4 mililitros de DMEM suplementados con un 10% de FBS a las placas, de modo que el medio solo entre en contacto gradualmente con las unidades de matriz DRG.

Regrese las placas a la incubadora durante otras 48 a 72 horas. Cuando las neuritas alcancen al menos el 75% del camino hasta el borde de la matriz, aspire el medio de los pocillos sin quitar las unidades matriz-DRG. Luego, usando una pipeta de 200 microlitros con un gatillo suave, coloque dos gotas de 3 por 10 a las quintas células por mililitro de medio sobre cada ensayo DRG de matriz y devuelva las placas a la incubadora. Después de una hora, agregue suavemente 4 mililitros de DMEM con 10% de FBS a lo largo de la pared lateral de la placa con fondo de vidrio y devuelva las placas a la incubadora hasta su próxima evaluación microscópica.