Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 4:13 min. • July 8th, 2025
El glioblastoma posee células madre que migran a lo largo de los tractos axonales de las neuronas mielinizadas para invadir lugares distantes en el cerebro. Para recapitular la migración de glioblastoma o células GBM en neuronas in vitro, comience tomando un cubreobjetos de vidrio.
Active el cubreobjetos mediante un tratamiento con plasma de oxígeno y cebe con un agente funcionalizante. Este tratamiento facilita el acceso a los productos químicos en los pasos posteriores. Agregue una solución pegilada al cubreobjetos e incube. Esta solución recubre el cubreobjetos evitando la adhesión de neuronas en lugares aleatorios.
Dispense un polímero fotoiniciador en el cubreobjetos y móntelo en la cámara de imágenes. Coloque la cámara en la platina de un microscopio de fluorescencia. Una vez dentro, la iluminación UV activa las moléculas fotoiniciadoras localmente en las áreas designadas correspondientes a los micropatrones previstos.
Las moléculas fotoiniciadoras activadas escinden la capa PEG subyacente, generando el patrón deseado. Ahora, agregue la solución de laminina e incube. La laminina, una glicoproteína, se deposita en lugares específicos donde se ha eliminado la capa de PEG. Siembre el medio que contiene neuronas del hipocampo de rata en el cubreobjetos.
Incubar para permitir la adherencia de las neuronas a las matrices recubiertas de laminina para obtener cubreobjetos con micropatrones de neuronas. Deposite una suspensión de células GBM marcadas con fluorescencia sobre las neuronas micromodeladas. Imagen para ver las células GBM fluorescentes migrando a las neuronas.
Para hacer un sustrato para el micropatrón, trate los cubreobjetos de vidrio circulares de 18 milímetros mediante activación por aire o plasma durante 5 minutos antes de colocar los cubreobjetos en un desecador con 100 microlitros de 3-aminopropil trietoxisilano durante 1 hora. Luego, incube una solución de Peg-SVA a 100 miligramos por mililitro durante 1 hora para la deposición en gel. Al final de la incubación, agregue 3 microlitros de PLPP y 50 microlitros de etanol absoluto en el centro del portaobjetos y espere hasta que se seque por completo.
Para el micropatrón de portaobjetos de vidrio, monte el cubreobjetos en una cámara Ludin y coloque la cámara en la platina de un microscopio equipado con un sistema de enfoque automático. Después de la creación de imágenes, cargue las imágenes con micropatrones en el software. Después de la secuenciación automática de la iluminación UV, utilice una pipeta para lavar el PLPP del cubreobjetos extensamente con PBS. Luego, incube el cubreobjetos con 50 microgramos por mililitro de laminina durante 30 minutos, seguido de otro lavado con PBS como se demuestra.
Para configurar un cultivo de neuronas del hipocampo de rata embrionaria en los cubreobjetos microestampados, después del último lavado, rehidrate los portaobjetos de vidrio con medio de cultivo de células neuronales. Siembre 5 veces 10 a la cuarta neurona del hipocampo de rata suspendidas en medio neurobasal enriquecido con 3% de suero de caballo por centímetro cuadrado en cada cubreobjetos microestampado para una incubación de 24 horas en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius. Centrifugar células de glioblastoma disociadas durante 5 minutos a 1.000 rpm y volver a suspender el sedimento en medio de cultivo celular de glioblastoma. Luego, deposite 1 por 10 a las terceras células GBM sobre las neuronas micromodeladas.