Descelularización del complejo cardiopulmonar: una técnica para descelularizar el corazón y los pulmones a partir de un modelo murino

La descelularización priva a los órganos de sus componentes celulares, dejando intacta la estructura de la ECM. Esto ayuda a conservar la arquitectura 3D de los órganos. Para el procedimiento de descelularización, coloque un ratón sacrificado en posición supina. Diseccionar el ratón y exponer el complejo cardiopulmonar.

Lite todos los vasos principales que se originan en el corazón, excepto la aorta y los vasos principales de la circulación pulmonar. Este paso evita la fuga de líquido durante el procedimiento de perfusión posterior. Cree una abertura en la tráquea e inserte un catéter a través de esta abertura. Cateterizar la aorta descendente desde la parte inferior hasta que el catéter llegue al arco aórtico.

Sutura los catéteres para asegurar su posición y conéctalos a la bomba de perfusión. Comience la perfusión con agua desionizada. La perfusión a través de la aorta permite la extracción eficiente de sangre de toda la vasculatura cardíaca. Eventualmente, el agua ingresa a la arteria pulmonar que conduce a los pulmones.

Después de eliminar completamente la sangre de la vasculatura pulmonar, detenga la perfusión de agua y reemplácela con diferentes soluciones de detergente que van de suaves a fuertes. Este procedimiento lisa las células liberando los componentes intracelulares, haciendo que el corazón y los pulmones parezcan translúcidos.

Perfunda nuevamente con agua desionizada para eliminar las moléculas de detergente restantes. Almacene el complejo cardiopulmonar descelularizado en una solución que contenga antibióticos, lo que garantiza una larga vida útil.

Comience afeitando el tórax, el abdomen y la espalda del ratón sacrificado con la cortadora de cabello. Desinfecte el área con etanol al 70%. Luego, sujete el mouse a una bandeja de poliestireno, extendiendo sus extremidades delanteras y traseras, así como su cabeza y cola. Colóquelo bajo el microscopio de microcirugía.

Con unas tijeras de patrón recto Mayo, haga una incisión cutánea que vaya desde la región submandibular hasta la parte inferior del abdomen y diseccione subcutáneamente para exponer la pared torácica y el peritoneo. Luego, use tijeras microquirúrgicas para cortar los músculos pectoral mayor y pectoral menor a lo largo del sexto espacio intercostal a ambos lados de la pared torácica.

Corta el esternón a lo largo de las incisiones anteriores con unas tijeras de patrón recto. Luego, complete una esternotomía cortando el esternón a lo largo de su eje largo. Eleve y sujete ambos lados de la pared torácica para exponer el complejo cardiopulmonar. Use micropinzas de punta redonda para extirpar el timo y el tejido adiposo circundante tirando delicadamente de sus uniones y corte el esófago con microtijeras.

Separe las venas braquiocefálicas y la arteria braquiocefálica con micropinzas afiladas. Luego, separe las arterias carótida común izquierda y subclavia izquierda del tejido subyacente para facilitar la ligadura y la cauterización. Use un soporte para microagujas y microfórceps afilados y una sutura 9-0 para colocar puntos por encima de la aparición de las arterias braquiocefálica, carótida común izquierda y subclavia izquierda. Cauterizar las venas braquiocefálicas.

Con unas microtijeras, abra una entrada seccionando el ligamento. Introduzca un catéter de calibre 27 en la tráquea y empuje delicadamente hasta que la tráquea se ramifique en los bronquios, teniendo cuidado de no interrumpir los bronquios. Con una sutura 6-0, coloque tres puntos alrededor de la tráquea para asegurar el catéter.

Secciona el ratón a la altura de la 12ª vértebra torácica. La aorta descendente corre anterior a la columna vertebral y debe seccionarse aquí junto con la columna vertebral. Cateterizar retrógradamente la aorta y empujar el catéter hasta que llegue al arco aórtico. Con una sutura, coloque cuatro puntos alrededor de la aorta comenzando 5 milímetros por debajo de la punta del catéter.

Conecte el mouse a un sistema de bomba mediante tubos de silicona y conectores inferiores. Perfundir con agua desionizada a 200 microlitros por minuto durante 15 minutos. Luego, cambie el agente de perfusión a DOC al 0,5% diluido en agua desionizada y perfunda durante la noche. Al día siguiente, cambie el agente de perfusión a SDS al 0,1% diluido en agua desionizada y perfundido durante 8 horas. Luego, perfunda con agua desionizada durante 24 horas para eliminar la SDS y el DOC.

Reseque el corazón y los pulmones descelularizados seccionando sus uniones al tórax. Almacene el tejido en un criotubo estéril en agua desionizada con penicilina-estreptomicina al 1% y azida de sodio micromolar al 0,3 a 4 grados centígrados.