JoVE Encyclopedia of Experiments
Biología
0 vistas • 3:38 min • July 8th, 2025
La superficie dorsal de la lengua del ratón está cubierta con tres tipos principales de protuberancias elevadas llamadas papilas, a saber, papilas fungiformes, circunvaladas y filiformes. Las papilas circunvaladas, o CVP, que comprenden trincheras epiteliales que albergan las papilas gustativas, están sostenidas por una capa de tejido conectivo: la lámina propia.
Para aislar el epitelio CVP, comience con un ratón sacrificado en posición supina. A continuación, haga una incisión en las mejillas y diseccione la banda gruesa de tejido, el frenillo lingual, para separar la lengua del piso de la cavidad oral. Transfiera la lengua extirpada a un plato que contenga tampón frío.
A continuación, corte la parte anterior de la lengua. Inyecte con cuidado un cóctel de digestión que contenga enzimas dispasa y colagenasa en el espacio subepitelial de la región CVP, entre el epitelio y los tejidos subyacentes. Retraiga la aguja mientras inyecta la suspensión en la región.
Incube la lengua durante el tiempo adecuado. Las dispasas y las colagenasas digieren las proteínas de la matriz extracelular dentro del tejido conectivo, lo que facilita la separación del epitelio CVP del tejido. Después de la incubación, haga incisiones en el epitelio en la región CVP.
Separe suavemente el epitelio suelto del tejido subyacente. Finalmente, transfiera el epitelio CVP separado a un tubo recubierto de proteína para evitar que el tejido se adhiera a la pared del tubo. El epitelio CVP se puede almacenar para su posterior procesamiento.
Después de sacrificar a un ratón adulto, use tijeras de disección estériles grandes para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Luego, levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del piso de la cavidad oral. Corta la lengua y recógela en dPBS estéril helado con calcio y magnesio.
Bajo un microscopio de disección, retire y deseche la lengua anterior cortando justo antes de la eminencia intermolar con una cuchilla de afeitar. Luego, usando una toallita de tarea delicada para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.
Luego, llene una jeringa de 1 mililitro con 200 a 300 microlitros de solución enzimática inyectable e inserte una aguja de calibre 30 de 1/2 pulgada justo por encima de la eminencia intermolar hasta el interior de las papilas circunvaladas o CVP. Inyecte la solución enzimática debajo y en los bordes laterales del CVP entre el epitelio y los tejidos subyacentes. Retire la jeringa lenta y continuamente de la lengua mientras se inyecta la solución.
Incube la lengua en dPBS estéril sin calcio / magnesio a temperatura ambiente durante exactamente 33 minutos. Con unas tijeras de disección extra finas, haga pequeños cortes en el epitelio bilateralmente y justo antes de la CVP. Luego, pele suavemente el epitelio levantándolo con pinzas finas. Una vez que el epitelio de la zanja esté libre del tejido conectivo subyacente, colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros previamente recubierto con FBS.