Inyección de microburbujas en embriones aislados de ratón: una técnica para administrar agentes de contraste de microburbujas en la vasculatura de embriones murinos vivos

Para la administración de microburbujas, comience con una suspensión uniforme de microburbujas con cubierta de lípidos dirigidas a células endoteliales que comprenden un núcleo gaseoso en una jeringa conectada al tubo.

Cargue este conjunto en una bomba de jeringa y conecte una aguja de vidrio al tubo. Ahora, transfiera un embrión de ratón refrigerado que expresa receptores específicos de células endoteliales a un plato colocado en el escenario de un estereoscopio.

Exteriorizar suavemente el embrión desde el saco vitelino y la membrana amniótica. Asegure el saco y los bordes de la placenta. Enjuague el embrión con un tampón tibio para restaurar su flujo sanguíneo. Cubra el embrión con gel de ultrasonido precalentado para una transmisión óptima de ondas de ultrasonido. Complementar con tampón para mantener sus condiciones fisiológicas.

Inyecte con cuidado la suspensión de microburbujas al caudal deseado en una vena adecuada en la superficie de la membrana fetal del disco placentario con la bomba de jeringa. Las microburbujas inyectadas viajan a través de la circulación y se unen a los receptores específicos en las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos.

Use un transductor de ultrasonido para transmitir ondas de ultrasonido de alta frecuencia al embrión. Los núcleos de gas altamente compresibles de las microburbujas hacen que oscilen de forma no lineal, dispersando ondas de ultrasonido con frecuencias diferentes a las ondas incidentes. Estas señales y las señales lineales del tejido regresan al transductor.

El transductor los transmite a un sistema de imágenes que diferencia las señales dispersas de microburbujas de las señales tisulares, produciendo imágenes de ultrasonido mejoradas con contraste de los vasos sanguíneos embrionarios.

Pipetear el volumen necesario de solución madre de microburbujas y añadir a la alícuota de solución salina. Mezclar removiendo suavemente con la punta de la pipeta. Luego, use una aguja de calibre 21 para extraer la solución de microburbujas diluida en una jeringa limpia. Después de retirar la aguja, elimine las burbujas de aire de la jeringa y conecte el luer y el tubo. Empuje lentamente la solución hasta el extremo del tubo, asegurándose de no generar burbujas de aire.

Finalmente, inserte la jeringa en una bomba de infusión de jeringa para dispensar las microburbujas a una velocidad de 20 microlitros por minuto para un volumen total de 20 microlitros. Coloque una aguja de vidrio tirada en el extremo del tubo. Mueva la bomba cerca de la etapa de inyección. Use una cuchara perforada para seleccionar y extraer al azar un embrión de la placa de medios refrigerada. Coloque el embrión en una placa de disección ubicada en la etapa de ultrasonido debajo del estereoscopio.

A continuación, localiza el lado del embrión que parece menos vascularizado. Aquí hay un área de baja vascularización, generalmente adyacente a la región de la cabeza. Luego, use fórceps finos para cortar o rasgar lo suficiente del saco vitelino y las membranas amnióticas para poder extraer el embrión desde adentro, pero no más. A continuación, maniobre suavemente el saco alrededor del embrión. Luego, coloque el embrión de lado con la placenta y los vasos umbilicales al frente.

Estabilice la placa de disección con pequeños trozos de plastilina. Con cuatro alfileres de insectos, sujete el saco vitelino y los bordes de la placenta, evitando los vasos principales. Con una jeringa que contenga PBS precalentado a 45 grados Celsius, lave el embrión hasta que se pueda ver que la sangre fluye hacia el embrión. La arteria umbilical se identifica por la sangre pulsátil de color rojo brillante. La vena umbilical y su red vascular asociada tienen sangre más oscura y generalmente se superponen a las de la arteria umbilical en el lado placentario.

En este punto, coloque el plato de modo que la inyección se pueda realizar cómodamente. Una vez que el embrión haya revivido, cúbralo, pero no la placenta, con gel de ultrasonido precalentado. Use fórceps finos para eliminar delicadamente las burbujas de aire alrededor del embrión y rellene el plato con PBS precalentado. Durante todo el procedimiento, vigile el nivel de solución en el PBS y las jeringas de gel y agregue jeringas de respaldo al vaso de precipitados calefactor según sea necesario.

A continuación, monte la aguja de vidrio en una bola grande de plastilina en el borde del plato de disección e inserte el extremo de la aguja en el PBS. Elija una vena en la superficie coriónica del disco placentario lo más lejos posible de la rama principal. Luego, use tijeras para recortar la punta de la aguja para que coincida con el tamaño del vaso, cortando la punta en un ligero ángulo. Usa el borde de las tijeras de resorte para quitar los bordes irregulares del vidrio.

Ahora, usando la bomba de jeringa, inyecte lentamente la solución de microburbujas a 20 microlitros por minuto en la aguja de vidrio hasta que todo el aire sea expulsado de la punta de la aguja y se pueda ver que las microburbujas fluyen libremente hacia el PBS. Detenga la bomba y reiníciela para un volumen de inyección de 20 microlitros. No permita que entre aire en la aguja de inyección para evitar inyectar aire en el sistema vascular del embrión.

Inserte la punta de la aguja de vidrio suavemente en la vena seleccionada de la placenta y asegúrese de que esté inmóvil. Gire el cabezal del estereoscopio y coloque el transductor de ultrasonido de modo que el embrión quede situado uniformemente entre los focos a 6 y 10 milímetros. A continuación, inicie las imágenes e inicie la inyección en bolo de las microburbujas. Después de un minuto, cuando se complete la inyección, inicie el temporizador para el paso de adquisición de datos.