Aislamiento de bacterias conjuntivales comensales basado en hisopos: una técnica para aislar bacterias comensales de la conjuntiva de un modelo murino

La conjuntiva del ojo alberga bacterias comensales. Esta microflora autóctona protege el ojo de las infecciones activando las células inmunitarias para atacar cualquier microbio dañino que ingrese a los revestimientos de los ojos.

Para aislar las bacterias comensales, coloque un ratón anestesiado en posición lateral. Tome un hisopo ocular estéril humedecido en un medio adecuado. Inserte la punta del hisopo húmedo en la región conjuntival medial del ojo izquierdo. Presione el globo ocular y mueva el hisopo hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la conjuntiva para recolectar una población comensal diversa.

Retire el hisopo y revuélvalo en un tubo que contenga medios de enriquecimiento microbiano. Este paso libera las bacterias atrapadas de la malla de algodón del hisopo en el medio. Deseche el hisopo e incube el tubo para facilitar la aparición del crecimiento bacteriano.

Dispense unas gotas del medio enriquecido inoculado con hisopo ocular en una placa de agar de sangre en el patrón deseado e incube. La caseína y las peptonas de soja presentes en el medio suministran el nitrógeno necesario para la síntesis de péptidos, mientras que el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico.

Las bacterias comensales poseen enzimas hemolisinas que digieren la hemoglobina presente en los medios sanguíneos. Esto produce un patrón característico en la placa de agar, lo que hace que diferentes bacterias proliferen en colonias morfológicamente distintas. Cuente el número de colonias para determinar su abundancia relativa en la conjuntiva.

Asegúrese de que el ratón esté correctamente anestesiado apretando una almohadilla para las patas traseras. Solo proceda si no hay movimiento. Asigne una mano para manipular ratones anestesiados y la otra mano para manipular el hisopo ocular y el cultivo. Retire el ratón de la jaula y colóquelo encima de la superficie de trabajo colocada de lado con el ojo izquierdo expuesto. Rocíe las manos enguantadas con isopropanol y séquelas con una toalla de papel.

Destape un tubo de microcentrífuga BHI etiquetado con la mano dedicada a la manipulación de medios y vuelva a colocar el tubo en la gradilla. Sumerja la punta de algodón del hisopo ocular en el BHI. Luego, retire el hisopo del tubo mientras gira la punta dos veces contra el tubo interior para eliminar el exceso de líquido y eliminarlo.

Con la mano que maneja el mouse, sosténgalo suavemente por el pescuezo. Con la otra mano, coloque la punta del hisopo ocular contra la región conjuntival medial del ojo izquierdo. Presione ligeramente el globo ocular y mueva el hisopo con un movimiento de lavado de ventanas entre el párpado inferior y el ojo 10 veces, manteniendo una presión constante. Sin tocar el pelaje, retire suavemente la punta del hisopo perpendicular a donde se insertó. Coloque el hisopo con el algodón hacia abajo directamente en un tubo de microcentrífuga etiquetado con medios BHI.

Aplique una gota para los ojos en el ojo frotado. Si lo desea, adquiera hisopos de piel o piel para muestras de control, esterilizando los guantes adecuadamente entre cada hisopo. Cuando termine, regrese el ratón a la jaula. Deje reposar el hisopo durante 10 a 15 minutos sobre hielo. Luego, esterilice las manos enguantadas y retire el hisopo mientras mezcla la punta en el medio durante 10 rotaciones. Retire el hisopo girando la punta contra la pared interna del tubo durante cinco rotaciones y deséchelo en un recipiente de riesgo biológico. Repita el proceso para cada mouse.

Enriquezca la muestra incubando los tubos estáticamente durante 1 hora a 37 grados centígrados. Durante la incubación, etiquete una placa TSA a temperatura ambiente por hisopo de ojo de ratón o hisopo de control y divídalo por la mitad. Retire las muestras enriquecidas de la incubadora y colóquelas en hielo. Agite brevemente las muestras para mezclar. Luego, alícuota 10 microlitros de la muestra en la placa TSA e incline la placa para formar una tira. Repita esto dos veces.

Al otro lado de la línea divisoria de la placa, cree 10 puntos con 10 microlitros de muestra cada uno. Incube las placas a 37 grados centígrados durante 18 horas, 2 días y 4 días en una cámara limpia que evite que las placas de agar se sequen. Cuente las colonias en las tiras. Tenga en cuenta la morfología y calcule las unidades formadoras de colonias por hisopo para aislados morfológicamente similares.