Aislamiento de células intersticiales de válvula de ratón: un método enzimático para aislar y cultivar VICs de válvula aórtica de ratón

La válvula aórtica del corazón es una estructura de tres valvas compuesta por las células intersticiales de la válvula interna o VIC distribuidas por toda la matriz extracelular densa y las células endoteliales de la válvula suprayacente o VEC.

Para aislar los VIC, primero, prepare un ratón sacrificado en posición supina. A través de la incisión abdominal y torácica de la línea media, exponga el corazón. Haga una pequeña hendidura entre la aurícula izquierda y el ventrículo seguida de perfusión salina para drenar la sangre. Cortar la aorta ascendente a nivel del arco aórtico y cosechar el corazón.

Seccionar y desechar los dos tercios distales de los ventrículos antes de diseccionar longitudinalmente la porción restante del corazón para revelar las valvas de la válvula aórtica en forma de "U". Extirpe los folletos y enjuague con un tampón frío para eliminar la sangre.

Posteriormente, tratar las valvas con una solución de colagenasa de baja concentración e incubar. En bajas concentraciones, la colagenasa, una enzima proteolítica, solo descompone parcialmente la matriz extracelular, desalojando los VEC superficiales de las valvas.

Centrifugar y reemplazar el sobrenadante que contiene enzimas con tampón, transfiriendo el gránulo resuspendido a una placa de Petri. Recoja los folletos y trátelos con una solución de colagenasa de alta concentración para una segunda digestión. Tras la incubación, la colagenasa degrada aún más la matriz extracelular, liberando VIC en solución.

Centrífuga para peletizar los VIC y volver a suspender en medios adecuados. Finalmente, siembre un bajo volumen de la suspensión celular en una placa de pocillos múltiples para facilitar la adherencia de los VIC al fondo del pocillo. Incubar para permitir que los VIC proliferen.

Antes de comenzar el experimento, limpie y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y el espacio de trabajo con etanol al 70% y autoclave los instrumentos quirúrgicos durante 30 minutos. Cuando la configuración inicial esté lista, comience limpiando el pecho y la región del abdomen de un ratón sacrificado de 8 semanas con etanol.

Con unas tijeras, abra el abdomen y el pecho del ratón. Luego, corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo con unas tijeras quirúrgicas pequeñas. Extraer sangre del corazón mediante la perfusión de 10 mililitros de PBS frío y cortar el corazón manteniendo 3 milímetros de la aorta ascendente. Bajo un microscopio estereoscópico, diseccionar la válvula aórtica cortando el corazón horizontalmente en el medio de los ventrículos y cortando el ventrículo izquierdo hacia la aorta. Luego, disecciona cuidadosamente la válvula aórtica. Reúna las válvulas en una pequeña placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros.

Lavar las válvulas aisladas en una placa de cultivo celular de 75 mililitros con 5 mililitros de HEPES frío de 10 milimolares recién preparado suplementado con antibióticos e incubar en 5 mililitros de colagenasa tipo I durante 30 minutos a 37 grados centígrados con agitación continua. Después de la incubación, centrifugar el tubo durante 5 minutos a 150 x g y lavar el pellet una vez con 2 mililitros de HEPES milimolar con vórtice a alta velocidad durante 30 segundos.

Recoja la suspensión resultante del tubo en una placa de cultivo de 35 milímetros y use pinzas delgadas para transferir cuidadosamente los fragmentos de tejido a un tubo nuevo. Luego, incube el gránulo en un tubo de 15 mililitros a 5 mililitros de colagenasa tipo I a 37 grados centígrados bajo agitación continua durante 35 minutos. Separe las células resuspendiendo con una pipeta de 1 mililitro y centrifugue a 150 x g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Limpie las celdas dos veces resuspendiendo el gránulo separado en 2 mililitros de DMEM completo y centrifugando a 150 x g durante 5 minutos a 4 grados centígrados.

Para el siembra, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de medio completo y agréguelo a un pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos en una cantidad mínima de medio. Mantenga las placas intactas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Después de 3 días de incubación, confirme el crecimiento más cercano a los restos de tejido observando las células bajo el microscopio. Una vez que 1,000 células sean visibles, retire con cuidado los restos de tejido con pinzas esterilizadas en autoclave y cambie el medio.