Imágenes intravitales: un método para la observación a nivel celular del páncreas de ratón a través de una ventana de imagen estabilizada

Las imágenes intravitales implican la visualización de células de un animal vivo a través de una ventana de imágenes implantada en el animal. Permite la observación a largo plazo de la dinámica celular sin comprometer sus funciones.

Para comenzar, tome un ratón transgénico anestesiado previamente implantado con una ventana de imagen pancreática apoyada en una placa de metal. La placa base separa espacialmente el páncreas del intestino, reduciendo así los artefactos de movimiento de movimientos fisiológicos como el peristaltismo.

El ratón transgénico expresa la proteína verde fluorescente o GFP bajo el promotor del gen de la insulina expresado en las células beta de los islotes en el páncreas.

A continuación, sujete firmemente la cola del ratón y rocíe desinfectante para eliminar cualquier contaminante de la superficie. Inserte un catéter en la vena lateral de la cola. Inyecte una solución que contenga anticuerpos marcados con una sonda fluorescente roja en la vena de la cola. Estos anticuerpos se unen a las células que recubren los vasos sanguíneos, tiñéndolos de rojo.

Ahora, cambie el mouse a una configuración de microscopía intravital. Inserte la ventana de imágenes pancreáticas en el soporte de la ventana. Comience a obtener imágenes con poco aumento para localizar grupos de islotes fluorescentes verdes rodeados de vasos sanguíneos fluorescentes rojos. Aumente el aumento para obtener imágenes de alta calidad a nivel celular de células beta individuales.

Comience encendiendo el microscopio intravital, incluida la potencia del láser. Para insertar un catéter vascular, aplique presión en el lado proximal de la cola con el índice y el tercer dedo. Si es necesario, caliente la cola con una lámpara. Desinfecte la vena de la cola con un aerosol de etanol al 70%, luego, inserte un catéter de calibre 30 en la vena lateral de la cola y visualice la regurgitación de sangre en el tubo PE-10. Aplique cinta de seda en el catéter para estabilizarlo.

Inyecte dextrano FITC y dextrano TMR, u otras sondas fluorescentes, según corresponda, de acuerdo con la combinación de sondas fluorescentes. Inserte una sonda rectal para controlar automáticamente la temperatura corporal con el sistema de almohadillas térmicas homeotérmicas. Luego, inserte la ventana de imágenes pancreáticas preparada durante la configuración de microscopía intravital en el soporte de la ventana. Transfiera el ratón de la plataforma quirúrgica a la etapa de imágenes.

Para realizar imágenes intravitales, comience con imágenes del páncreas con un aumento bajo, como cuatro veces, para escanear toda la vista del páncreas en la ventana de imágenes pancreáticas. Una vez que se haya determinado la región de interés, cambie a una lente de objetivo de mayor aumento, como 20 o 40 veces, para realizar imágenes a nivel celular con resolución lateral y axial de aproximadamente 0,5 micrómetros y 3 micrómetros, respectivamente.

Realice imágenes de pila z o lapso de tiempo para observar la estructura 3D o la dinámica a nivel celular, como la migración celular.