Aislamiento de células IPE y RPE: una técnica para obtener células epiteliales pigmentarias oculares a partir de ojo de conejo

Las células epiteliales pigmentarias son células cuboides diferenciadas terminalmente conectadas por uniones estrechas. Estas células epiteliales que recubren el iris son las células epiteliales pigmentarias del iris o IPE, y las que están cerca de la retina son las células epiteliales pigmentarias de la retina o EPR.

Para extraer estas células, tome un ojo de conejo intacto. Trate el ojo con un desinfectante para eliminar cualquier microorganismo de la superficie del ojo. Lave el desinfectante con una solución tampón. Haga una incisión cerca del iris. Usando esta abertura, haga un corte circular completo a lo largo del límite del iris, dividiendo el ojo en un segmento anterior que contiene el iris y una parte posterior que comprende la retina y el humor vítreo.

Toma el segmento anterior y desecha el cristalino para acceder al iris. Retire el iris y colóquelo en una fuente de cultivo. Posteriormente, tome el segmento posterior y deseche el humor vítreo gelatinoso y la retina del bulbo del ojo.

Trate el iris y el bulbo del ojo con tripsina e incube. La tripsina degrada la unión estrecha y las proteínas de la matriz extracelular, iniciando la disociación de las células epiteliales. Deseche la tripsina y agregue un medio de cultivo adecuado. Raspe suavemente la superficie del iris y el bulbo del ojo para liberar las células epiteliales en el medio.

Finalmente, siembre las células IPE y RPE en pocillos separados. Las células están listas para más ensayos posteriores.

Después de sacrificar al animal, use tijeras curvas y fórceps Colibri para enuclear los ojos, luego limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos. Recoja los ojos en un tubo de 50 mililitros lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinféctelos sumergiéndolos en una solución a base de yodo durante dos minutos, luego transfiera los ojos a un tubo de 50 mililitros lleno de PBS estéril.

Coloque un ojo en una compresa de gasa estéril y sostenga firmemente el ojo cerca del nervio óptico, luego corte cerca del límite del iris con un bisturí # 11. Con unas tijeras, corte alrededor del iris, retire el segmento anterior y colóquelo en una placa de Petri dejando el bulbo con el vítreo, hasta que se aísle el epitelio pigmentario de la retina, o células del EPR.

Para aislar el epitelio pigmentario del iris, o células IPE, retire el cristalino con pinzas finas y extraiga delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril. Agregue 500 microlitros de tripsina al 0,25% e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego.

Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros. Cuente las células usando la cámara de Neubauer y siembre 0,2 millones de células por pocillo en una placa de 24 pocillos con 1 mililitro de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultícela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Para aislar las células del EPR, elimine el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pinzas delgadas. Coloque los bulbos en una placa de 24 pocillos y agregue 500 microlitros de tripsina al 0,25% por ojo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo por globo y raspe las células del EPR con delicadeza con una pipeta Pasteur curvada pulida al fuego.

Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros. Cuente las células usando la cámara de Neubauer y siembre las células como se describió anteriormente. Coloque la placa en la incubadora.