Aislamiento de células IPE y RPE: una técnica para obtener células epiteliales pigmentarias oculares a partir de ojo de conejo
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biología
0 vistas • 4:17 min • July 8th, 2025
Las células epiteliales pigmentarias son células cuboides diferenciadas terminalmente conectadas por uniones estrechas. Estas células epiteliales que recubren el iris son las células epiteliales pigmentarias del iris o IPE, y las que están cerca de la retina son las células epiteliales pigmentarias de la retina o EPR.
Para extraer estas células, tome un ojo de conejo intacto. Trate el ojo con un desinfectante para eliminar cualquier microorganismo de la superficie del ojo. Lave el desinfectante con una solución tampón. Haga una incisión cerca del iris. Usando esta abertura, haga un corte circular completo a lo largo del límite del iris, dividiendo el ojo en un segmento anterior que contiene el iris y una parte posterior que comprende la retina y el humor vítreo.
Toma el segmento anterior y desecha el cristalino para acceder al iris. Retire el iris y colóquelo en una fuente de cultivo. Posteriormente, tome el segmento posterior y deseche el humor vítreo gelatinoso y la retina del bulbo del ojo.
Trate el iris y el bulbo del ojo con tripsina e incube. La tripsina degrada la unión estrecha y las proteínas de la matriz extracelular, iniciando la disociación de las células epiteliales. Deseche la tripsina y agregue un medio de cultivo adecuado. Raspe suavemente la superficie del iris y el bulbo del ojo para liberar las células epiteliales en el medio.
Finalmente, siembre las células IPE y RPE en pocillos separados. Las células están listas para más ensayos posteriores.
Después de sacrificar al animal, use tijeras curvas y fórceps Colibri para enuclear los ojos, luego limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos. Recoja los ojos en un tubo de 50 mililitros lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinféctelos sumergiéndolos en una solución a base de yodo durante dos minutos, luego transfiera los ojos a un tubo de 50 mililitros lleno de PBS estéril.
Coloque un ojo en una compresa de gasa estéril y sostenga firmemente el ojo cerca del nervio óptico, luego corte cerca del límite del iris con un bisturí # 11. Con unas tijeras, corte alrededor del iris, retire el segmento anterior y colóquelo en una placa de Petri dejando el bulbo con el vítreo, hasta que se aísle el epitelio pigmentario de la retina, o células del EPR.
Para aislar el epitelio pigmentario del iris, o células IPE, retire el cristalino con pinzas finas y extraiga delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril. Agregue 500 microlitros de tripsina al 0,25% e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego.
Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros. Cuente las células usando la cámara de Neubauer y siembre 0,2 millones de células por pocillo en una placa de 24 pocillos con 1 mililitro de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultícela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Para aislar las células del EPR, elimine el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pinzas delgadas. Coloque los bulbos en una placa de 24 pocillos y agregue 500 microlitros de tripsina al 0,25% por ojo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo por globo y raspe las células del EPR con delicadeza con una pipeta Pasteur curvada pulida al fuego.
Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros. Cuente las células usando la cámara de Neubauer y siembre las células como se describió anteriormente. Coloque la placa en la incubadora.
Descripción general
Este artículo describe el aislamiento de células del epitelio pigmentario del iris (IPE) y del epitelio pigmentario de la retina (RPE) a partir de ojos de conejo. El proceso implica una disección cuidadosa y un tratamiento enzimático para disociar las células y poder realizar ensayos posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología celular
- Neurociencia
- Oftalmología
Antecedentes
- Las células epiteliales pigmentadas del iris son cúbicas y están completamente diferenciadas.
- Estas células son fundamentales para diversas funciones oculares.
- El aislamiento de estas células es esencial para aplicaciones en investigación y terapéuticas.
- Se requieren técnicas adecuadas para mantener la viabilidad y funcionalidad celular.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para el aislamiento de células IPE y RPE.
- Facilitar ensayos posteriores con fines de investigación.
- Mejorar la comprensión del comportamiento celular en tejidos oculares.
Métodos Utilizados
- Desinfección y preparación de los ojos de conejo.
- Diseción para separar los segmentos anterior y posterior.
- Uso de tripsina para disociar las células epiteliales.
- Recuento de células y siembra en placas de cultivo para su crecimiento.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de células IPE y RPE de ojos de conejo.
- Las células eran viables y adecuadas para ensayos posteriores.
- El protocolo demostró reproducibilidad y eficiencia.
- La morfología celular se mantuvo después del aislamiento.
Conclusiones
- El método descrito es eficaz para aislar células IPE y RPE.
- Estas células pueden utilizarse para diversas aplicaciones experimentales.
- Estudios futuros pueden basarse en este protocolo para investigaciones avanzadas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células del epitelio pigmentario ocular permite la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas terapéuticas para enfermedades retinianas, al proporcionar un sistema relevante para ensayos funcionales. Esta técnica facilita el desarrollo de ensayos y la criba fenotípica de estrategias terapéuticas dirigidas a enfermedades degenerativas de la retina. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al proporcionar células primarias similares a las humanas para estudios de interacción con la diana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en las vías del epitelio pigmentario del iris y de la retina.
- Valor operativo: Proporciona células terminalmente diferenciadas para la validación funcional de dianas y la reducción biológica de riesgos.
- Valor estratégico: Apoya la confianza predictiva y la selección de carteras para programas de enfermedades oculares.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos funcionales y genéticos posteriores.
- Valor operativo: Asegura la estandarización del ensayo, la reproducibilidad y lecturas cuantitativas basadas en células.
- Valor estratégico: Mejora la preparación para cribados y la reutilización de plataformas para la evaluación de compuestos en dianas oculares.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades en la investigación de la degeneración retiniana.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando células primarias.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la reducción del riesgo mecanicista de las vías diana.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento, desde la validación del objetivo hasta la investigación preclínica, al proporcionar células epiteliales oculares primarias para ensayos mecanicistas y fenotípicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la biología de las células epiteliales pigmentadas.
- Tamizaje: Proporciona células listas para ensayos con aislamiento reproducible y siembra cuantitativa para la selección de compuestos.
- Análisis: Permite el recuento celular, la evaluación de viabilidad y lecturas posteriores para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante células primarias relevantes para enfermedades, para la validación de dianas retinianas.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo de aislamiento reutilizable para un suministro constante de células IPE y RPE en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en objetivos oculares.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del aislamiento de células primarias.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance/no avance, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en etapas tardías en programas retinianos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance basadas en la validación funcional del objetivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección ocular y técnicas de cultivo celular primario.
- Necesita instrumentos estériles, tripsina, medio de cultivo e infraestructura para el recuento de células.
- Exige estandarización entre equipos de los protocolos de disección y disociación enzimática.
- Incluye consideraciones de adaptación para el manejo de diferentes tejidos oculares y variaciones específicas de la especie.
- Comprende limitaciones prácticas, como la disponibilidad de tejido y la optimización enzimática para obtener un rendimiento celular constante.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón
Videos relacionados
0 Vistas
Cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo Ex Vivo de la membrana de Bruch humano envejecido
Videos relacionados
0 Vistas
Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario
Videos relacionados
0 Vistas
Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología
Videos relacionados
0 Vistas
Aislamiento de células IPE y EPR: una técnica para obtener células epiteliales pigmentadas a partir de ojo porcino aislado
Videos relacionados
0 Vistas
Aislamiento de células EPR e IPE del ojo bovino: un procedimiento para cosechar y cultivar células epiteliales de pigmento primario bovino
Videos relacionados
0 Vistas
Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral
Videos relacionados
0 Vistas
Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón
Videos relacionados
0 Vistas
Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina
Videos relacionados
0 Vistas
Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias
Videos relacionados
0 Vistas
Última actualización: 29 agosto 2026