Modelo de Córnea Porcina Ex vivo de Queratitis Bacteriana: Una Técnica para Establecer la Infección Bacteriana en las Células Epiteliales de la Córnea

En el ojo de los vertebrados, la córnea, la cubierta protectora más externa, está infectada por Pseudomonas aeruginosa, lo que resulta en una afección inflamatoria corneal: queratitis.

Para establecer un modelo de queratitis corneal ex vivo, coloque un botón corneoescleral de ojo porcino en una placa de Petri. Este segmento de tejido consiste en la córnea rodeada de restos de esclerótica, la cubierta fibrosa de los ojos. Complemente la placa de Petri con medios que contengan antibióticos para eliminar los microbios contaminantes de la superficie epitelial de la córnea.

Localiza la parte central de la córnea. Realizar incisiones superficiales horizontales y verticales en el patrón deseado perforando la capa epitelial corneal más externa. Transfiera el tejido inciso, con la córnea hacia abajo, a un molde hueco especializado.

Llene la cavidad corneal con agar licuado y deje que se solidifique, restringiendo el tejido dentro del molde. Invierta el molde para exponer la superficie herida del epitelio corneal. Pipetear la suspensión de Pseudomonas en las zonas incisas de la córnea. Superponga el molde con más medio de crecimiento para un crecimiento bacteriano óptimo. Complemente la placa de cultivo con medios e incube.

Las bacterias atraviesan la incisión epitelial para invadir el estroma. Dentro del estroma, las bacterias provocan la infiltración de células inmunitarias, proteínas y líquido en la córnea, lo que resulta en una respuesta inflamatoria. La acumulación de líquido aumenta la opacidad corneal, lo que confirma la queratitis bacteriana.

Retire el medio de la placa de Petri y enjuague las córneas dos veces con un mililitro de PBS estéril. Sostenga la córnea con fórceps y apriete suavemente. Use un bisturí 10A para hacer cuatro cortes, dos verticales y dos horizontales, en la sección central del botón corneoescleral a través de la capa epitelial hasta el estroma subyacente.

Coloque un molde de vidrio estéril en un plato de seis pocillos con la parte ancha hacia arriba. Luego, coloque la córnea en el medio del molde de vidrio, con el lado del epitelio hacia abajo y la parte herida de la córnea centrada en el molde de vidrio.

Llene completamente el molde de vidrio agregando un mililitro de solución de agar. Después de dejar que el agar se endurezca, invierta el molde de vidrio para que el epitelio corneal quede hacia arriba.

El molde de vidrio debe sellarse con agar hasta el borde para evitar fugas del inóculo o la solución farmacológica.

Pipetear 200 microlitros del cultivo bacteriano directamente en un área cortada. Además, para cada experimento, configure un control agregando 200 microlitros de PBS estéril a una córnea, en lugar de agregar el cultivo bacteriano.

A continuación, agregue 185 microlitros de PBS en la parte superior de cada córnea para mantener el epitelio húmedo. Luego, agregue un mililitro de DMEM sin antibióticos al fondo de cada pocillo. Incube la placa de seis pocillos a 37 grados centígrados con humedad y dióxido de carbono al 5%, hasta por 24 horas.

Deseche el DMEM de la placa de seis pocillos y agregue un mililitro de PBS estéril a cada pocillo para enjuagarlo. Retire el PBS suavemente, sin tocar la parte central del botón corneoescleral. Retire el molde de vidrio con pinzas estériles y colóquelo en Distel. Enjuague suavemente la parte superior del botón corneoescleral dos veces con un mililitro de PBS.

Use pinzas de punta fina para levantar el borde del botón corneoescleral, sepárelo del agar debajo y transfiéralo a un tubo de 50 mililitros lleno de uno o dos mililitros de PBS helado. Para ayudar a separar las bacterias del epitelio corneal y el área cortada, agregue PBS al tubo y use un homogeneizador de punta fina para cortar la parte superior de la córnea infectada. El tejido no tiene que estar completamente licuado.

Vortex para resuspender las bacterias sedimentadas y agregar 20 microlitros de la córnea homogeneizada a 180 microlitros de PBS. Luego, realice diluciones en serie del homogeneizado en una placa de 96 pocillos.

Pipetear 10 microlitros del homogeneizado diluido en una placa de agar sangre.

Después de incubar la placa durante 16 horas, cuente el número de unidades formadoras de colonias.