0 visualizaciones • 4:35 min. • July 8th, 2025
Los bronquiolos son las vías respiratorias tubulares de los pulmones. Durante la infección crónica, los bronquiolos se obstruyen debido a la acumulación de moco. El moco rico en nutrientes proporciona un entorno adecuado para que crezcan las bacterias oportunistas. Estas bacterias se incrustan en una matriz polimérica extracelular de producción propia y proliferan para formar una biopelícula.
Para imitar el desarrollo de biopelículas bacterianas en los pulmones, tome una muestra de tejido bronquiolar de cerdo en una placa de Petri. Disecciona el tejido en trozos de la forma deseada. Agregue un medio de cultivo de biopelícula a la placa de Petri. Esterilice el plato bajo luz ultravioleta para eliminar cualquier contaminante de la superficie.
Transfiera las piezas de tejido esterilizadas a una placa multipocillo que contenga medios de cultivo de biofilm y almohadillas de agarosa, que sirven como sustrato óptimo para la adhesión bacteriana. A continuación, pinche una punta de aguja que contenga una colonia de las bacterias deseadas en cada pieza de tejido para introducir bacterias planctónicas en el tejido. Selle la placa con una membrana porosa esterilizada por UV que facilita el intercambio uniforme de oxígeno en toda la superficie de la placa. Incuba la placa sellada.
Durante la incubación, las bacterias se adhieren irreversiblemente a la superficie epitelial a través de pili y comienzan a secretar la matriz extracelular. Dentro de la matriz, las bacterias utilizan las fuentes de energía, mucina y ADN libre de los medios de cultivo para formar biopelículas. El modelo de biopelícula bacteriana está listo para realizar más pruebas.
Coloque el bronquiolo en el primer lavado DMEM / RPMI 1640. Déjelo en el lavado y recolecte secciones adicionales de bronquiolo del mismo pulmón para producir suficientes secciones de tejido para el experimento planificado. Coloque cualquier sección bronquiolar adicional del mismo pulmón en el lavado y déjela en el lavado durante al menos dos minutos.
Retire los bronquiolos del primer lavado y coloque las muestras en una placa de Petri estéril. Sostenga ligeramente cada bronquiolo con fórceps estériles, teniendo cuidado de no dañar el tejido. Retire la mayor cantidad posible de tejido blando restante y córtelo en tiras de cinco milímetros de ancho con unas tijeras de disección estériles.
Coloque todas las tiras de tejido bronquiolar en el segundo lavado DMEM / RPMI 1640. Déjalos en el lavado durante al menos dos minutos. Luego, retire las tiras de tejido del segundo lavado con pinzas estériles y colóquelas en una placa de Petri limpia y estéril. Retire cualquier resto de tejido blando adherido al bronquiolo y corte las tiras en cuadrados con unas tijeras de disección estériles.
Agregue el tercer lavado DMEM / RPMI 1640 en la placa de Petri y mezcle ligeramente los trozos de tejido en el lavado girando el plato. Vierta el tercer lavado de la placa de Petri sin quitar los trozos de tejido.
Luego, agregue el lavado final de SCFM, asegurándose de que todas las piezas de tejido estén cubiertas. Esterilice el tejido en SCFM bajo luz ultravioleta durante cinco minutos. Use pinzas estériles para transferir cada pieza de tejido bronquiolar esterilizado a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contiene almohadillas de agarosa SCFM.
Para infectar cada pieza de tejido con la cepa bacteriana deseada, toque una colonia cultivada en una placa de agar con la punta de una aguja de calibre 29 unida a una jeringa de insulina estéril de 0,5 mililitros. Luego, toque la colonia sobre la pieza de tejido, pinchando suavemente la superficie. Para los controles no infectados, pinche suavemente la superficie de la pieza de tejido con la punta de la aguja.
Luego, use una pipeta para agregar 500 microlitros de SCFM a cada pocillo. Esterilice una membrana de sellado transpirable para cada placa de 24 pocillos bajo luz ultravioleta durante 10 minutos. Retire la tapa de la placa de 24 pocillos y reemplácela con la membrana transpirable. Luego, incube las placas a 37 grados centígrados sin agitar.