Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena

La nucleasa de dedo de zinc o ZFN contiene un macrodominio de unión al ADN estabilizado con iones de zinc conectado a un dominio de endonucleasa a través de un enlazador. Esta estructura ayuda a mantener la especificidad mientras corta el ADN.

Para usar ZFN para la edición del genoma, tome un cultivo de células madre pluripotentes humanas. Complételo con un plásmido que codifique ZFN. Agregue un plásmido de reparación que contenga el gen diana y el gen de resistencia a los antibióticos intercalado entre brazos de homología o HA. Electroporar la mezcla célula-ADN donde la corriente eléctrica facilita la entrada de plásmidos dentro de la célula.

Una vez dentro, los motivos de dedos de zinc de ZFN traducido se unen a los tripletes de pares de bases complementarios en el genoma del huésped, posicionando correctamente la endonucleasa de restricción Fok-1 en el sitio objetivo. Los ZFN se unen a hebras opuestas en pares, lo que permite que la homodimerización de Fok-1 forme un centro catalítico activo en el que Fok-1 genera roturas de doble hebra de ADN o DSB, produciendo un saliente de cuatro nucleótidos.

La presencia de HA en el plásmido de reparación guía la reparación dependiente de homología donde el extremo sobresaliente se invierte y utiliza la secuencia homóloga de HA como plantilla. La síntesis de ADN continúa agregando nucleótidos complementarios al gen diana.

Los espacios resultantes se ligan, lo que facilita la inserción de genes. Además, el gen de resistencia a los antibióticos sin promotor se expresa a partir de un promotor del huésped aguas arriba del sitio de inserción. Las células editadas con éxito crecen en el medio de selección de antibióticos.

Comience cultivando células madre pluripotentes humanas en medios hESC en una placa de 6 pocillos que contenga células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados con mitomicina C, o MEF, cultivadas en gelatina. Cada día posterior después de la siembra, hasta que la hPSC haya alcanzado el 50% de confluencia, utilice una pipeta de vidrio y aspire para eliminar todo el volumen de medios. Reemplácelo con 3 mililitros de medio hESC tibio por pocillo.

Un día antes de la focalización, retire el medio hESC y agregue medios hESC precalentados frescos complementados con 10 micromolares Y27632. Además, prepare una o dos placas de 6 pocillos de células alimentadoras de MEF resistentes a los medicamentos de ratones DR4. El día de la orientación, prepare las soluciones de transfección pipeteando 5 microgramos de plásmidos 1 y 2 de expresión de nucleasa de dedo de zinc en un tubo de 1,5 mililitros.

Agregue 30 microgramos del plásmido del donante de reparación, seguido de suficiente solución salina tamponada con fosfato 1X para llevar el volumen a 300 microlitros. Inspeccione las células bajo un microscopio para garantizar una confluencia del 50%. A continuación, utilice una pipeta de vidrio y aspire para retirar el medio de la placa de hPSC. Luego, lave las células con 2 mililitros de PBS 1X tibio. Después de aspirar el PBS, agregue 0,5 mililitros de solución de tripsina EDTA al 0,25%, directamente sobre las células.

Coloque en la incubadora de cultivo de tejidos durante aproximadamente 10 minutos, o hasta que la capa de alimentación comience a levantarse de la placa. Después de la incubación, agregue 2 mililitros de medios esWash tibios a cada pocillo para detener la reacción de tripsina. Recoja las células de cada pocillo, asegurándose de que las células alimentadoras salgan como una hoja. Pipetee el contenido de cada pocillo en un solo tubo cónico de 50 mililitros, combinando todos los pocillos, y triture las células con una pipeta serológica de 10 mililitros.

Agregue medios esWash para llevar la suspensión celular a 40 mililitros. Espere de uno a dos minutos para permitir que los trozos grandes del alimentador se asienten en el fondo del tubo, luego, retire el sobrenadante con una pipeta serológica y deposite en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Después de centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 190 x g, aspire el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Resuspender las células en 500 microlitros de 1X PBS.

Combine las células resuspendidas con la solución de transfección de plasma preparada anteriormente. Pipetee las células y la mezcla de transfección en una cubeta de electroporación de 4 milímetros y colóquelas en hielo durante tres a cinco minutos. Establezca los parámetros para el programa exponencial en el sistema de electroporación en 250 voltios, 500 microfaradios, resistencia infinita y tamaño de cubeta de 4 milímetros. Electropora las células y luego vuelve a colocar la cubeta en hielo durante tres minutos.

Vuelva a suspender las celdas electroporadas en 18 mililitros de medios hESC calientes suplementados con 10 micromolares Y27632. Inspeccione los MEF DR4 bajo un microscopio. Coloque 3 mililitros de la suspensión unicelular en cada pocillo de una placa de 6 pocillos que contenga células alimentadoras DR4 y devuélvalos a la incubadora. Al tercer día después del enchapado, reemplace el medio en las celdas con medio hESC sin Y27632. El día 4, reemplace los medios no suplementados con medios que contengan el antibiótico de selección apropiado. Aquí se usa puromicina.