Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 6:34 min. • July 8th, 2025
La nucleasa de dedo de zinc o ZFN contiene un macrodominio de unión al ADN estabilizado con iones de zinc conectado a un dominio de endonucleasa a través de un enlazador. Esta estructura ayuda a mantener la especificidad mientras corta el ADN.
Para usar ZFN para la edición del genoma, tome un cultivo de células madre pluripotentes humanas. Complételo con un plásmido que codifique ZFN. Agregue un plásmido de reparación que contenga el gen diana y el gen de resistencia a los antibióticos intercalado entre brazos de homología o HA. Electroporar la mezcla célula-ADN donde la corriente eléctrica facilita la entrada de plásmidos dentro de la célula.
Una vez dentro, los motivos de dedos de zinc de ZFN traducido se unen a los tripletes de pares de bases complementarios en el genoma del huésped, posicionando correctamente la endonucleasa de restricción Fok-1 en el sitio objetivo. Los ZFN se unen a hebras opuestas en pares, lo que permite que la homodimerización de Fok-1 forme un centro catalítico activo en el que Fok-1 genera roturas de doble hebra de ADN o DSB, produciendo un saliente de cuatro nucleótidos.
La presencia de HA en el plásmido de reparación guía la reparación dependiente de h
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