JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 2:15 min • July 8th, 2025
Las nanocuchillas son partículas sintéticas similares a virus sin el material genético viral encapsulado, lo que las convierte en portadoras adecuadas para la carga extraña en las células huésped. Estas nanocuchillas se construyen utilizando el núcleo retroviral del virus de la leucemia de ratón rodeado por la membrana de bicapa lipídica derivada de las células productoras eucariotas utilizadas para ensamblar nanocuchillas in vitro.
El núcleo contiene la enzima Cas9 complejada con el sgRNA específico de la secuencia del genoma diana. Las proteínas centrales están rodeadas por las proteínas de la envoltura que contienen un dominio transmembrana o TM que pasa a través de la bicapa lipídica. El TM se une a un dominio superficial glicoproteico extracelular o SU que sobresale de la capa bicapa.
Para usar nanoblades para la edición de genes, tome un cultivo de células diana adherentes y complételo con la solución de nanoblades. En el cultivo, el SU que sobresale de una nanocuchilla reconoce el receptor correspondiente en la superficie de la célula huésped y se une a él. Esto conduce a modificaciones en la estructura del dominio SU, lo que facilita su liberación.
Estos cambios desencadenan los cambios conformacionales en el dominio TM, que luego se une a la membrana del huésped. Esta unión acerca la nanocuchilla a la célula huésped, lo que permite la fusión de la membrana bicapa viral con la membrana huésped, y el núcleo viral se mueve hacia el citoplasma.
Una vez dentro de la célula, el núcleo se desintegra, liberando el complejo Cas9-sgRNA que puede realizar la edición del genoma en su sitio objetivo.
Para la transducción de células diana con nanocuchillas, reemplace el medio de cultivo celular con 500 microlitros del medio que contiene nanocuchillas purificadas. Después de cuatro a seis horas de incubación celular, reemplace el medio a la cantidad normal de medio fresco.