Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

Para microinyectar ADN exógeno en el embrión de Anopheles, tome la cantidad deseada de huevos de mosquito pre-blastodermo recién cosechados. En esta etapa temprana de desarrollo, el óvulo contiene núcleos sin formar estructuras celulares.

Coloque los huevos en forma de bote en la periferia de un papel secante húmedo presente en la superficie de un portaobjetos de vidrio. Este paso asegura una hidratación adecuada del embrión para facilitar la inyección en los pasos posteriores. Alinee los huevos adyacentes entre sí con su superficie ventral expuesta hacia afuera.

Ahora, tome una aguja de microinyección de calibre estrecho que contenga la solución plásmida deseada. Use un microscopio de disección para colocar la aguja cerca del polo posterior del óvulo, un sitio para los precursores de células germinales. Inserte la aguja en un ángulo apropiado para que perfore el exocorion, la capa externa, y el endocorion, una capa interna de la cáscara del huevo, que finalmente llegue al embrión.

Inyecte la mezcla de plásmidos en la yema del embrión. Retraiga suavemente la aguja y deje que los huevos crezcan en condiciones adecuadas. A medida que el óvulo crece, algunos núcleos migran al polo posterior, donde pueden incorporar el ADN microinyectado. Estos núcleos luego se convierten en gametos, las células sexuales que pueden resultar en mutaciones hereditarias de la línea germinal.

Visualice los mosquitos adultos para el fenotipo transformado: las características observables en las generaciones posteriores que confirman el éxito de la microinyección.

Use una punta de microcargador para llenar las agujas con dos microlitros de mezcla de ADN. Inserte la aguja en el portaagujas y conecte el tubo de la bomba de presión automatizada. Alinee la aguja para que forme un ángulo de 15 grados con el plano de la corredera.

Abra la punta de la aguja tocando con cuidado el primer huevo. Luego, inserte la punta de la aguja a unos 10 micrómetros en el polo posterior. Una inyección exitosa conducirá a un pequeño movimiento del citoplasma dentro del óvulo.

Use los controles de la platina coaxial del microscopio para pasar al siguiente huevo y continuar con la inyección. Para asegurarse de que la punta de la aguja permanezca abierta y no se haya obstruido, presione el botón 'Inyectar' antes de ingresar a otro embrión y visualice la pequeña gota en la abertura de la aguja. Si la aguja se obstruye, presione el botón 'Borrar' para despejar la aguja y repita la prueba de visualización de gotas.

Ajuste la presión según sea necesario, si la abertura de la punta de la aguja se agranda un poco para asegurarse de que el tamaño de la gota se mantenga pequeño. Inyecte alrededor de 40 a 50 huevos con una aguja. Una vez completadas las inyecciones, enjuague los huevos en un recipiente de vidrio forrado con papel de filtro y lleno de 50 mililitros de agua desionizada.