Transformación genética mediada por agrobacterias: un método para transformar genéticamente el genoma del arroz a través de Agrobacterium tumefaciens modificado genéticamente

Agrobacterium tumefaciens, una bacteria patógena de plantas, puede ser modificada genéticamente mediante la introducción de un plásmido de Ti preparado artificialmente, que lleva un gen de interés en su región de transferencia de ADN o ADN-T, y un plásmido auxiliar que lleva la virulencia o los genes Vir para transferir el ADN-T a las células vegetales.

Para la transformación genética mediada por Agrobacterium, comience con una inflorescencia de arroz joven y córtela en trozos pequeños. Transfiera los esquejes a un medio de crecimiento e incube para facilitar el crecimiento de los esquejes en una masa celular indiferenciada llamada callo.

Ahora, transfiera el callo a un medio de infiltración de Agrobacterium que contenga acetosiringona, un quimioatrayente para Agrobacterium. A continuación, agregue un cultivo de Agrobacterium genéticamente modificado al medio e incube brevemente.

Las moléculas de acetosiringona activan la proteína receptora celular - VirA - en la membrana de Agrobacterium, lo que media aún más la fosforilación de una proteína activadora transcripcional - VirG. El VirG fosforilado se mueve hacia el plásmido auxiliar y activa la transcripción de una cascada de genes de virulencia, incluidas las proteínas del canal y las endonucleasas: VirD1 y VirD2.

Las proteínas del canal forman un canal de transporte que conecta la célula bacteriana y vegetal, mientras que las endonucleasas se unen a las secuencias de borde en el plásmido Ti y escinden el ADN-T con VirD2, unido en un extremo. A partir de entonces, VirD2 dirige la entrada de ADN-T a través del canal de transporte en las células del callo y facilita su integración en el genoma del arroz.

Limpie cada inflorescencia con un hisopo con alcohol al 70% y déjelo secar antes de cortarlo. Lleve la inflorescencia a una mesa de laboratorio estéril y córtela en trozos pequeños con unas tijeras esterilizadas. Luego, transfiera los esquejes a una placa de Petri que contenga medio NBD2.

Incube la placa en la oscuridad a 26 grados centígrados, durante 10 a 14 días para inducir callos. Para realizar la transformación, transfiera una sola colonia de la placa YEB con antibióticos selectivos a 5 mililitros de medio YEB líquido que contenga los mismos antibióticos, en un tubo de ensayo estéril cónico de 50 mililitros. Agite el tubo en un agitador orbital a 250 x g y de 25 a 28 grados Celsius hasta que las bacterias crezcan a un OD₆₀₀ de 0.5.

Agregue 1 mililitro de suspensión bacteriana a 100 mililitros de medio YEB con los mismos antibióticos selectivos, en un matraz cónico de 250 mililitros, y agite el matraz en un agitador orbital a 250 x g y 28 grados Celsius durante cuatro horas. Centrifugar el cultivo a 4.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, para recoger las bacterias. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo con medio AAM-AS y diluya la suspensión a OD₆₀₀ de 0.4.

Después de la incubación, recolecte alrededor de 150 callos embriogénicos sanos de color amarillo claro en un matraz estéril de 150 mililitros. Agregue de 50 a 75 mililitros de la suspensión de células bacterianas en el matraz y luego agregue de 10 a 25 mililitros de medio AAM-AS fresco, para sumergir el callo durante 10 a 20 minutos, agitando ocasionalmente.

Vierta la suspensión bacteriana del matraz con cuidado y seque el callo con papel de filtro estéril. Luego, colóquelos en una placa de Petri con medio NBD-AS y cúbralos con papel de filtro. Incube los callos a 25 a 28 grados Celsius en la oscuridad durante tres días, revisándolos en busca de crecimiento excesivo de bacterias.

Después de tres días de cocultivo, transfiera los callos a una placa de Petri estéril con papel de filtro, luego séquelos al aire durante dos horas en un banco limpio. Asegúrese de que los callos no estén adheridos al papel de filtro y transfiéralos al medio de selección primario NBD2.

Después de dos semanas, transfiera los callos uniformemente a una nueva placa que contenga medio de selección fresco. Luego, mueva los callos a medio MS fresco para diferenciarlos, y los brotes a medio MS (con 10 mg / L de higromicina) para proliferar más brotes.