JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:59 min • July 8th, 2025
Para la administración de ADN plasmídico basado en electroporación en células neuronales primarias, comience con una suspensión de células en medios de electroporación adecuados. Agregue ADN plasmídico que codifica proteínas fluorescentes para preparar la mezcla de electroporación.
Transfiera suavemente la mezcla de electroporación a una cubeta de electroporación, evitando burbujas de aire que podrían afectar negativamente la eficiencia de la electroporación. Transfiera la cubeta al soporte de la cubeta del electroporador; Establezca los parámetros de electroporación. Iniciar la electroporación.
Los pulsos eléctricos cortos de alto voltaje aplicados a través de la membrana celular causan una acumulación de carga diferencial a ambos lados de la membrana, aumentando el potencial transmembrana, el voltaje a través de la membrana celular.
Cuando el potencial transmembrana inducido excede el potencial de ruptura de la bicapa lipídica, la bicapa lipídica se desestabiliza con el cambio de configuración localizado, formando poros hidrófilos transitorios en la membrana celular. Los poros con un tamaño adecuado proporcionan una vía para que el ADN plasmídico ingrese al citoplasma celular.
Al finalizar la electroporación, la bicapa lipídica se vuelve a sellar, restaurando la integridad de la bicapa de la membrana celular, atrapando así el ADN plasmídico. Además, durante la fase del ciclo celular cuando la membrana nuclear, la membrana de doble capa que rodea el núcleo, se desensambla, el ADN plasmídico se transloca al núcleo.
Placas de celdas electroporadas en pocillos que contienen medios de una placa de pocillos múltiples con cubreobjetos recubiertos de proteínas. Incube para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos recubierto de proteínas. Las células transfectadas con éxito que contienen ADN plasmídico expresan las proteínas fluorescentes.
Para comenzar, agregue 0,5 mililitros de medio de cultivo en cada pared de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene cubreobjetos recubiertos y manténgalo caliente a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Pipetee el número requerido de células en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y centrifugue a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 200 microlitros de Opti-MEM. Repita este procedimiento dos veces para asegurarse de que no haya medio de cultivo residual en el tubo. Establezca los parámetros de electroporación como se indica. Pipetee la reacción de electroporación suavemente para mezclar bien y use una punta de pipeta P200 larga para transferir un volumen exacto de 100 microlitros de la mezcla a la cubeta de espacio de dos milímetros.
Una vez que la cubeta esté dentro de la cámara de cubetas, presione el botón omega del electroporador y anote el valor de impedancia adhiriéndose a un volumen preciso de 100 microlitros. El rango de valores de impedancia debe ser aproximadamente 30 y 35.
Presione el botón Start para iniciar el pulso. Registre los valores de corriente medidos y las joyas que se muestran en el marco de lectura. Retire la cubeta de la cámara.
Agregue inmediatamente 100 microlitros de medio de cultivo precalentado en la cubeta y vuelva a suspenderlo pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Transfiera inmediatamente la suspensión celular a la placa de 24 pocillos previamente preparada. Incube las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono.