Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 5:33 min. • July 8th, 2025
Comience con un volumen óptimo de perlas de oro, vehículos de administración de genes biológicamente inertes y no tóxicos, en un tubo de microcentrífuga. Luego, agregue agentes catiónicos: espermidina y cloruro de calcio, seguidos de los fragmentos de ADN deseados a las cuentas de oro. Mueva suavemente el tubo e incube.
El cloruro de calcio se une a los fragmentos de ADN y facilita su recubrimiento sobre las perlas de oro a través de los residuos de espermidina. A continuación, centrifugar y eliminar el disolvente. Vuelva a suspender las perlas recubiertas de ADN en etanol. Pipetea suavemente las perlas en un disco macroportador estéril. Déjalo secar.
Configure un aparato de pistola genética biolítica que comprende un tubo de aceleración de gas helio y una cámara de bombardeo con un disco de ruptura y una pantalla de parada en sus respectivas ranuras. A continuación, invierta el disco macroportador y cárguelo debajo del disco de ruptura.
A continuación, coloque las células huésped objetivo cultivadas en un medio sólido adecuado suplementado con sorbitol, un estabilizador osmótico para mejorar la eficiencia de transformación. Una vez que la configuración esté lista, dispara la pistola genética.
A medida que el helio viaja por el tubo de aceleración, la presión continúa aumentando hasta que el disco de ruptura se rompe, creando ondas de choque de helio. Estas ondas de choque impulsan el disco macroportador que transporta las perlas de oro hacia la pantalla de detención, lo que permite que solo pasen las perlas de oro.
Las perlas de oro aceleradas penetran en el núcleo de la célula huésped, integrando el ADN deseado en el genoma de la célula huésped.
Comience usando fórceps para sumergir discos biolísticos macroportadores de color naranja en etanol al 100%, luego, transfiera los discos a una placa de Petri grande que contenga drierita, teniendo cuidado de que los discos no toquen el desecante. Una vez secos, presione los discos en soportes de discos de plata limpiados con etanol, luego, haga un vórtice con un tubo de perlas de oro y alícuotas 12 microlitros de la solución de perlas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por transformación.
A continuación, agregue secuencialmente 2 microgramos de ADN, 10 microlitros de cloruro de calcio y dos microlitros de base libre de espermidina en cada tubo de perlas. Agite cada muestra en vórtice y luego incube los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos, con movimientos suaves ocasionales para volver a suspender las perlas sedimentadas.
Al final de la incubación, pegue las perlas de oro recubiertas de ADN y aspire cuidadosamente el sobrenadante. Vuelva a suspender lentamente las perlas por completo en 600 microlitros de etanol al 100%, luego, vuelva a granular las células, esta vez resuspendiendo las perlas en 8 microlitros de etanol.
Ahora dispense cada tubo de cuentas en el centro de un disco biolítico individual en círculos de 1 centímetro de diámetro. Si hay una concentración suficiente de cuentas, se verá un círculo dorado en el centro de cada disco una vez que las cuentas estén secas.
Para operar la pistola genética, primero, encienda la bomba de vacío, luego gire la perilla del tanque de helio en sentido antihorario hasta que se alcance una presión de aproximadamente 2200 PSI en el manómetro. A continuación, gire el interruptor rojo izquierdo para encender la pistola genética y ajuste las tasas de flujo para la aspiradora y la ventilación para que la aspiradora alcance las 28 pulgadas de mercurio en 15 segundos. Confirme que la distancia entre el disco de ruptura y el macroportador es de aproximadamente 3/8 de pulgada en este momento también.
Cuando todo esté en posición, limpie toda la cámara con etanol al 70% y sumerja los discos de ruptura en etanol al 100%. Después de secar los discos sobre una superficie estéril, use una llave dinamométrica para aflojar el soporte del disco de ruptura e inserte un disco limpio. Vuelva a atornillar el soporte del disco de ruptura en su lugar y gírelo una vez hacia la derecha con la llave dinamométrica para apretarlo.
A continuación, sumerja las pantallas de malla en etanol al 100%. Una vez seco, coloque una pantalla en la placa de montaje de plástico blanco y coloque el soporte del disco macroportador, con el ADN hacia abajo, en la cámara del disco. Atornille la tapa plateada y coloque la placa de montaje en la ranura más alta, luego, coloque una placa de agar YPD que contenga 1 molar de sorbitol en la placa inferior.
Ahora cierre la puerta de la cámara y bloquéela en su lugar, luego, presione y mantenga presionado el interruptor rojo del medio en la posición hacia arriba para activar la aspiradora y permitir que alcance las 28 pulgadas de mercurio. Una vez que se alcanza el nivel de vacío adecuado y el interruptor central se ha movido a la posición hacia abajo, mantenga presionado el interruptor rojo derecho para disparar.
Cuando el disco de ruptura estalle, suelte inmediatamente el botón de disparo y presione el interruptor rojo del medio a la posición central para ventilar la cámara a 0 PSI. Si el disparo fue exitoso, se verá un anillo de oro en la placa. Limpie el disco de ruptura y los restos del disco macroportador, y apague la pistola genética, luego, gire la perilla del tanque de helio en el sentido de las agujas del reloj para apagar el gas y apagar la bomba de vacío.